乳腺癌组织中PPARγ与内分泌治疗预测指标相关性
【摘要】 ［目的］ 研究乳腺癌组织中过氧化物酶增殖激活受体γ( peroxisome proliferator activated receptors γ ,PPARγ )的表达与 ER、PR、pS2、C-erbB-2 之间的关系，探讨其临床意义。［方法］应用组织芯片和免疫组织化学EnVision 法检测 71 例乳腺癌组织和 41 例非癌组织 PPARγ、 ER、PR、pS2、C-erbB-2的表达。［结果］ （1）71 例乳腺癌中 PPARγ、ER、PR、pS2 和C-erbB-2的阳性表达率分别为 47.89％、64.79％、61.97％、39.44％ 和 40.85％。（2）PPARγ 的表达与组织学分级呈正相关（P<0.01）。（3）PPARγ 的表达与 ER、PR表达分别呈正相关(C1=0.3102，C2＝0.2441)，与pS2、C-erbB-2的表达无显著性相关(P>0.05 )。［结论］ PPARγ在分化较好和 ER阳性乳腺癌中高表达，与 ER、PR、pS2、C-erbB-2联合检测有助于指导内分泌及评估预后。
【关键词】 乳腺肿瘤
Correlation between PPARγ and the Predictors of Endocrinotherapy in Breast Cancer Tissue
Abstract: ［Purpose］ To investigate expression of peroxisome proliferator activated receptors γ (PPARγ) in breast cancer and to explore their significance and relationships with estrogen receptors(ER), progesteron receptors(PR), pS2 and C-erbB-2. ［Methods］ The expressions of PPARγ, ER, PR, pS2 and C-erbB-2 in tissues of 71 cases with breast cancer and non cancer tissues of 41 cases were detected by microarray and immunohistochemistry with EnVision methods. ［Results］ (1) The positive rates of PPARγ, ER, PR, pS2 and C-erbB-2 in 71 cases with breast cancer were 47.89%, 64.79%, 61.97%, 39.44% and 40.85% respectively.（2）The expression of PPARγ was negatively correlated to histopathological grade (P<0.01 ). （3）The expression of PPARγ was positively correlated to ER and PR (C1=0.3102，C2＝0.2441 ), but was not statistically correlated with pS2 and C-erbB-2 (P>0.05). ［Conclusions］ PPARγ is overexpressed in well-differentiated and ER-positive breast cancer. Combination examination of PPAR, ER, PR,pS2 and C-erbB-2 may be helpful for guiding endocrinotherapy and evaluating prognosis.
Key words: breast neoplasms; peroxisome proliferator activated receptorsγ; ER;PR; C-erbB-2
乳腺癌是一种激素依赖性全身性疾病，不同激素受体状态的乳腺癌患者在内分泌治疗反应性和预后方面存在明显差异。研究发现，ER-α作为乳腺癌内分泌治疗的金标准，在判断预后和激素治疗效果上并不完美。许多新的分子标记与乳腺癌的发生及药物疗效显示出密切相关性。因此，深入研究乳腺癌雌激素调节系统，对指导临床合理有效的治疗具有十分重要的意义。过氧化物酶增殖激活受体(peroxisome proliferator activated receptors，PPAR)是核激素受体超家族的成员，它是英国家 Issemann和Green[1]于1990 年首先发现的，分3种亚型:PPARα、PPARβ和PPARγ，具有促进脂肪细胞分化、胰岛素增敏、调节体内糖平衡、抑制炎性反应和保护心血管等多种生物学功能。资料表明，PPAR 家族的重要成员 PPARγ可以通过抑制脂肪代谢、干扰芳香化酶的表达等调节雌激素对局部乳腺脂肪组织中的生物学作用[2]，抑制乳腺上皮细胞的异常增殖和存活反应，诱导细胞凋亡。本研究通过组织芯片结合免疫组化 EnVision法检测了71例乳腺癌组织中 PPARγ的表达，以探讨其与内分泌治疗预测指标的相关性。
1 材料与方法
1.1 材 料
选取上海长海病理科2004年至2005年间存档的石蜡包埋乳腺癌标本71例，所有患者临床资料齐全，术前均未行放化疗，病理诊断结果经两名病理医师确认，其中乳腺浸润性导管癌 50 例、浸润性小叶癌10例、黏液腺癌6例、大汗腺癌3例、髓样癌2例，组织学分级Ⅰ级10例，Ⅱ级28例，Ⅲ级33例，均为女性，年龄≤40岁 16 例，41～60岁 45例，>60岁 10例，中位年龄 43岁，其中绝经前 42例，绝经后 29例，瘤体直径 ＜2cm 9例，2cm～5cm 42例，>5cm 20例；无淋巴结转移 31 例，有淋巴结转移 40 例。TNM分期Ⅰ期 8例，Ⅱ期 34例，Ⅲ期25例，Ⅳ期4例，另设对照组：非癌组织 41例，其中癌旁乳腺组织 18例（距癌缘>10cm），乳腺良性病变 23例，其中乳腺腺病 15例，乳腺纤维腺瘤 8例。所有病例组织学分类根据抗癌协会1999年《新编常见恶性肿瘤诊治规范》乳腺癌分册标准[3]，组织学分级参照[4]的方法，根据腺管形成、核的多形性、核分裂相等3项主要指标进行评分：①腺管形成>75%为1分；10%～75%为2分；<10%为3分；②核的多形性：与肿瘤周围正常乳腺组织比较。细胞规则、核小或稍大为1分；较正常上皮细胞大，有中度异形性，可见空泡核及核仁为2分；瘤细胞明显多形性，可见巨核及畸形核为3分；③核分裂相计数：在细胞生长活跃区，计数20个高倍视野(×400)，然后算出每10个高倍视野的核分裂相数。0～1个/ 10HPF为1分；2～3个/10HPF为2分；>3个/10 HPF为3分。以上3项相加，总分3～5分为Ⅰ级，低度恶性；6～7分为Ⅱ级，中度恶性；8～9分为Ⅲ级，高度恶性。TNM分期参照UICC(1988)标准。
1.2 方 法
1.2.1 组织芯片构建
根据苏木精—伊红( HE )染色切片选取存档组织蜡块，再用HE 染色的切片确定具有代表性的病变部位(癌和癌旁)，然后参照 Kononen等[5]建立的方法应用组织芯片构建仪(Beecher Instruments，Silver Spring，MD)制备组织芯片。
1.2.2 免疫组织化学染色
采用EnVision二步法(丹麦 Dako公司试剂盒)按说明书操作。兔抗PPARγ多克隆抗体（sc-1984）购自美国Santa cruz公司，工作浓度为1∶200，用已知阳性切片作阳性对照，用PBS替代一抗作阴性对照。
1.3 结果判断标准
PPARγ蛋白阳性染色为淡黄色、棕黄色或棕褐色，定位于乳腺上皮细胞核内。免疫组织化学结果判定采用二级计分法，阳性细胞计分标准为：≤5％为0分；6％～25％为1分；26％～50％为2分；51％～75％为 3分；>75％为4分。染色强度分级计分标准为：淡黄色为1分；黄或深黄色为2分；褐或棕褐色为3分。两者计分相乘≥1者为阳性。
1．4 统计学处理
SPSS 11.0软件包对所有数据作统计处理。各组间样本率差异的比较以及与临床参数之间的关系采用 χ2检验。
2 结 果
2.1 PPARγ蛋白在乳腺癌组织和非癌组织中的表达
构建组织芯片含112个位点，其中脱落5个位点用常规切片补充。癌组织中 PPARγ阳性定位于细胞核内，呈灶性或弥漫染色，胞浆及间质细胞表达量极少；非癌组织中阳性细胞呈片状或散在分布，且染色强度弱于非癌组织。PPARγ蛋白在乳腺癌及对照组中的阳性表达率分别为 47.89％和68.29％，乳腺癌组织阳性率低于对照组，差异有显著性（P<0.05），见表1。
2.2 PPARγ蛋白表达与肿瘤生物学行为间关系
组织学分级Ⅰ～Ⅱ级组 PPARγ 阳性率高于Ⅲ级组，差异有统计学意义(P<0.01)；PPARγ表达阳性率与患者年龄、瘤体直径、月经状态、组织学分型、腋窝淋巴结转移数目、临床分期无显著性相关(P>0.05)，见表2。
2.3 PPARγ表达与ER、PR的关系
PPARγ阳性的乳腺癌患者ER阳性率(94.1％，32/34)和PR阳性率(88.2％，30/34)分别显著性高于PPARγ阴性乳腺癌ER(37.8％，14/37)和PR(45.9％，14/37)阳性率(P<0.05)。PPARγ表达与 ER、PR 表达之间分别呈正相关(Pearson列联系数C1=0.3102和C2＝0.2441)。见表3。
2.4 PPARγ表达与pS2、HER-2的关系
PPARγ阳性乳腺癌患者pS2阳性率(58.8％，20/34)，PPARγ阴性乳腺癌患者pS2阳性率(21.6％，8/37)，两者间差异无显著性(P>0.05)。PPARγ阳性乳腺癌患者HER-2阳性率(41.2％，14/34)，PPARγ阴性乳腺癌患者HER-2 阳性率(40.5％，15/37)两组差异无显著性(P>0.05)，见表3。
3 讨 论
3.1 PPARγ在乳腺癌组织中表达的生物学意义
近来多种体外实验研究证实PPARγ被配体激活后在乳腺癌等多种肿瘤细胞系中发挥潜在的抗增殖效应。Suzuki T等[2]发现：在乳腺癌 MCF-7细胞系中，由配体介导的PPARγ活化可以显著抑制雌激素所介导的ERE（雌激素受体反应元件）的转录激活。研究还发现：PPARγ不仅可以影响含有ERE的雌激素敏感性基因，而且还可以影响 ER和其他 DNA结合转录因子交互作用所诱导的其他相关基因的表达，如抑癌基因p21、p27以及与肿瘤发生和血管生成密切相关的 COX-2等。Bonofiglio D等[6]运用瞬时转染、电泳迁移率变动分析和免疫共沉淀等方法分析MCF-7和HeLa细胞系中ER-α和PPARγ的转录过程，进一步证实：ER-α和PPARγ在生理调节和功能上存在交互作用。另外，有研究表明人类乳腺癌细胞系中PPARγ激活能抑制乳腺癌细胞株中的脂质过度累积及乳腺癌细胞的增殖[7]，可能的机制：① PPARγ激活后能加速CD36蛋白的表达，从而抑制了脂质累积达到抗细胞株增殖的效果；②PPARγ能抑制乳腺脂肪基质间质中芳香化酶的表达，从而抑制雌激素对局部乳腺脂肪组织中的生物学作用。PPARγ通过刺激脂肪基质中的L4抑制芳香化酶的表达，从而达到抑制乳腺癌细胞株生长的效果。
3.2 PPARγ与乳腺癌临床病理特征的关系
本研究显示PPARγ在癌组织中的表达显著低于非癌组织（P<0.05），提示在乳腺癌进展的过程中PPARγ可能是一个保护性因素，与Watkins等[8]结论相符。本研究还发现PPARγ表达与乳腺癌组织学分级密切相关（P<0.01），分化程度越高的肿瘤组织中PPARγ表达的阳性率越高，且阳性颗粒的分布在良恶性肿瘤中有所不同，在良性病变中多分布于正常乳腺上皮细胞、脂肪细胞的核内，但在乳腺癌组织中内皮细胞和间质亦有染色，提示在肿瘤组织中癌细胞和基质细胞均可分泌PPARγ，两者相互作用可能对乳腺癌的恶性生物学行为发挥重要作用。通常认为肿瘤大小决定病程长短及肿瘤的生物学特性。但本组研究并未发现PPARγ表达与乳腺癌的瘤体大小及月经状态有关，且不同表达状态的PPARγ在腋窝淋巴结转移潜能方面无显著性差异（P>0.05）。
3.3 PPARγ与ER、PR的关系
ER阳性乳腺癌呈激素依赖性，内分泌疗效较好。PR的合成有赖于雌激素和ER复合物，其表达反映细胞内ER作用机制的完整性，即功能性ER。故ER阳性者，PR多为阳性，但临床研究发现仍有40％ ER阳性和20％～30％ ER、PR均阳性的患者对内分泌治疗无反应且预后不良。本研究检测乳腺癌组织中PPARγ、ER、PR阳性率分别为 47.89％、64.79％、61.97％，且 PPARγ阳性乳腺癌的ER、PR阳性率显著高于PPARγ阴性乳腺癌，ER、PR的表达分别与PPARγ呈正相关，与以往报道相符。该结果从组织学水平进一步证实ER-α和PPARγ在生理调节和功能上存在交互作用，联合检测PPARγ对预测乳腺癌内分泌治疗的疗效及判断预后具有重要临床指导意义。
3.4 PPARγ与pS2的关系
pS2基因又称 BCEI（breast cancer estrogen induced）基因，是1982年Masialowski从激素依赖性乳腺癌 MCF-7细胞株中提取出来的雌激素诱导蛋白之一，在乳腺癌中表达阳性率约为43%～58%，与 ER、PR表达呈正相关。pS2主要在小于2cm肿瘤和分化好的肿瘤(组织学分级为Ⅰ~Ⅱ级)中表达，是不依赖于多种临床病理参数（年龄、肿瘤大小、淋巴结状态、临床分期）的独立预后指标，pS2阳性者预后好，复发率及死亡率均较低，且内分泌治疗有效。Schwartz(1991)对 72 例 进展期乳腺癌观察后发现：pS2阳性患者抗雌激素治疗有效率达76％，而ER阳性者有效率54％，PR阳性者45％。因此在预测抗雌激素治疗效果时，pS2可以作为一个重要指标。本组实验结果中ER与pS2之间表达呈显著正相关，pS2阳性率为39.44％，略低于相关报道，且未发现 PPARγ与pS2的表达具有相关性，提示在乳腺癌恶性进展的过程中PPARγ可能有不依赖于ER的作用途径发挥作用，该结果也可能与检测例数较少有关。
3.5 PPARγ与C-erbB-2基因的关系
C-erbB-2又称HER-2，为EGFR家族的Ⅱ型受体，是继 ER-α之后的第二个既是乳腺癌预后因子同时也是乳腺癌预测因子的基因。C-erbB-2癌基因的异常扩增见于25%~30%原发性乳腺癌病例，且仅限于癌细胞，而不出现于正常乳腺上皮。C-erbB-2 扩增与ER、PR表达呈负相关，其表达阳性者可使ER阳性病人对内分泌治疗的反应率降至20%；而ER阴性患者内分泌治疗几乎无效。ER、PR、pS2阳性表达的乳腺癌激素治疗的敏感性高，无C-erbB-2基因过度扩增的乳腺癌同样治疗敏感性增加。相反，前三者阴性而后者阳性的乳腺癌，通常其复发率、死亡率均高，预后差。临床研究表明，HER-2 过表达患者一线TAM治疗效果较差，二线治疗中甲地孕酮、甲羟孕酮的疗效也明显较HER-2阴性患者差，显示C-erbB-2过表达是抗雌激素类药物和孕激素类药物耐药的标志之一。许多回顾性研究已经明确证实：在一些ER阳性的肿瘤中，HER-2基因表达可能被雌激素部分或完全抑制，p185 HER-2过表达被认为是比激素受体更好的内分泌治疗反应性的预测指标，ER和p185 HER-2同时阳性的乳腺癌患者比ER阳性但p185 HER-2阴性的患者对治疗的反应性更低[9]。Zhibo Yang等[10]发现，HER-2/neu癌基因在MCF-7细胞系中可以通过脂肪脂合酶（FAS）显著上调PPARγ表达，并可以调节乳腺癌细胞对 PPARγ配体治疗的敏感性。但本组实验在肿瘤组织中并未检测到 C-erbB-2基因与PPARγ的表达存在明显相关性。
本组研究提示：PPARγ的表达与乳腺癌的组织学分级及ER、PR的状态显著相关，在分化较好和ER阳性的乳腺癌中对雌激素的活动具有调节作用，联合检测PPARγ的受体状态对于指导临床内分泌治疗及评估预后具有十分重要的意义。
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