次级淋巴组织趋化因子检测胃癌淋巴结微转移
作者：陈瑾 贾忠 封光华 贺冠海 罗中尧 蔡阳 谢琦 方欣
【摘要】 ［目的］ 探讨次级淋巴组织趋化因子（SLC）mRNA联合检测预测淋巴结微转移对胃癌病人的临床意义。［方法］ 分别用SLCmRNA RT-PCR 方法、细胞角蛋白CK20免疫组化染色法、常规病方法检测2003年至2006年间手术的35例胃癌病人的523个淋巴结。［结果］ 14例胃癌患者63个淋巴结免疫组化和常规组织学检查未证实淋巴结转移，而SLCmRNA表达减弱，提示存在隐匿性转移。分化差的患者微转移发生率高于分化好的患者。［结论］ SLCmRNA联合细胞角蛋白CK20免疫染色以及常规组织学检查可更准确地发现淋巴结微转移灶，有利于判断胃癌病人的预后。
【关键词】 胃肿瘤 微转移 细胞角蛋白 次级淋巴组织趋化因子
Secondary Lymphoid Tissue Chemokine mRNA Determination of Lymph Node Micrometastasis in Patients with Gastric Cancer
Abstract: ［Purpose］ To explore the significance of combined measurement of secondary lymphoid tissue chemokine mRNA for prediction micrometastasis of lymph nodes in patients with gastric cancer. ［Methods］ Five hundred and twenty-three lymph nodes removed from 35 cases with gastric cancer during 2003 to 2008 were examined by immunohistochemistry of cytokeratin and SLCmRNA RT-PCR. ［Results］ In 14 cases (63 lymph nodes) with gastric cancer, expression of SLCmRNA was reduced suggesting unconfirmed micrometastasis with immunohistochmical method and routine pathological method. The incidence of micrometastasis in undifferentiated carcinoma was higher than that in differentiated carcinoma. ［Conclusion］ Detection of lymph node micrometastasis and accuracy prediction of prognosis in patients with gastric cancer should be greatly enhanced if cytokeratin-specific immunohistochemstry, SLCmRNA and routine histopathological examination of lymph nodes are all adopted.
Key words: gastric neoplasms; micrometastasis; cytokeratin; secondary lymphoid tissue chemokine
局部淋巴结转移是判断胃癌患者预后的最重要因素之一。近年来，研究显示在乳腺癌及结直肠癌患者常规HE染色阴性淋巴结中，分子生物学技术能够发现淋巴结的隐匿性转移，并显示微转移的存在直接影响乳腺癌及结直肠癌病人的预后，但对胃癌患者淋巴结微转移的意义尚有争议，并引起许多学者的关注。本文通过RT?鄄PCR和免疫组织化学染色法分别测定胃癌患者中次级淋巴组织趋化因子（secondary lymphoid tissue chemokine，SLC）SLCmRNA，细胞角蛋白来分析淋巴结微转移的存在，并评估联合分子生物学方法在改善诊断的精确性及预测胃癌病人预后方面的临床意义。
1 材料及方法
1.1 标 本
选取2003年1月~2006年3月期间行根治性切除的35例胃癌患者。所有病人均无远处转移。随访时间为3个月~4年。
35例病人共切取淋巴结523个，每个淋巴结的一半经10%福尔马林固定及石蜡包埋，每一蜡块连续切取两片4μm厚组织，分别用作HE染色及细胞角蛋白特殊免疫染色,另一半组织迅速放入冻存管置液氮罐中保存，留待SLCmRNA的测定。
原发肿瘤及HE染色证实有转移的5个淋巴结作为阳性对照，而另取胃良性病变的5个淋巴结作为阴性对照。
1.2 角蛋白免疫组化染色
采用鼠单克隆抗体CAM5.2的SAB免疫过氧化酶法。先由有经验的病理学医生在不知临床病理信息的情况下对HE染色切片进行有无转移的观察，然后与免疫组织化学染色切片结果比较。当HE染色漏诊而免疫组化染色证实有淋巴结受累时，称之为微转移1。
1.3 淋巴结SLCmRNA的测定
用TRIZOL试剂RNA提取试剂盒(美国Life Technologies公司产品)提取总RNA，测定RNA纯度及浓度并对其完整性进行检测，以总RNA为模板，经逆转录得到cDNA。SLC的PCR引物序列及扩增条件参见Reape等[1]的报道。上游引物5′?鄄ATGGCTCAGTCACTGGCT?鄄3′；下游引物5′?鄄GGCCCTTTAGGGGTCTGT?鄄3′(引物由中科院上海生理研究所合成)，反应条件：预变性94℃，5min，变性94℃，1min，退火55℃，1min，然后延伸72℃，30s，最后一次延伸72℃，5min，共30个循环。产物片段为400bp，用3?鄄磷酸苷油醛脱氢酶G3PDH作内参照，引物序列如下，上游引物：5′?鄄TCCCTCAAGATTGTCAGCAA?鄄3′；下游引物:5′?鄄AGATCCACAACGGATACATT?鄄3′，产物片段为309bp。分子量参照物为PGEM?鄄7 Zf(+)/HaeⅢ。
结果观察：PCR产物在加溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶上电泳，于紫外灯下观察、照相，并进行图像分析，分析后的积分光度值均以同一样本中相应的G3PDH积分光度值校正，以淋巴结/正常组织(L/N) 积分光度值的比值反映淋巴结中SLC表达的相对含量。当HE染色和免疫组化染色漏诊，而淋巴结SLCmRNA积分光度值小于正常淋巴结均值的60%以下时为SLCmRNA表达减弱，称之为微转移2。
1.4 统计学分析
用t检验检测原发肿瘤临床病理特征与伴有隐匿性肿瘤细胞的淋巴结数量之间的关系；Generalized Wilmxon用于检测其差异之间的显著性意义。P值小于0.05则具有显著意义。
2 结 果
2.1 胃癌患者中微转移的发生率
在35例胃癌患者中，40%（14/35）患者淋巴结HE常规染色阴性而免疫组化染色发现有隐匿肿瘤细胞存在微转移1（54个），占切取淋巴结总数的10%（54/523）。
所有35例原发肿瘤均发现对抗角蛋白单克隆抗体产生阳性免疫反应。为保证实验的可靠性，随机选取5个经传统HE染色检测出转移的淋巴结作相应免疫组化检测，均呈阳性表达；相反，5个正常淋巴结，则均呈阴性表达。
胃癌患者不同组织的SLCmRNA积分光度值见表1。免疫组化和常规组织学检查发现的325个淋巴结转移的标本，SLCmRNA测定均明显减弱。但SLCmRNA含量分析还同时发现14例(40%)的胃癌有63个淋巴结可能存在微转移2，占切取淋巴结总数的12%（63/523）。
2.2 微转移发生与临床病理特征关系
由表2可见，病人的年龄、性别、肿瘤大小及淋巴管侵袭或血管侵袭均与微转移的发生率无明显关系。而分化差的患者微转移发生率较分化好的微转移发生率显著性增高(P<0.05)；浸润性生长的肿瘤较膨胀性生长的肿瘤则更易发生微转移(P<0.05)。
2.3 随访与预后
随访35例病人，7例病人死于肿瘤复发，其中3例淋巴结转移或腹膜种植转移，2例血源性转移，2例吻合口复发。分析显示7例患者均存在隐匿性淋巴结转移灶，其中3例存在微转移1，4例存在微转移2。其余28例至今尚存活，并继续系统。
3 讨 论
近年来，人们愈来愈关注恶性肿瘤淋巴结微转移的存在与预后的关系，并已发现在乳腺癌、结直肠癌病人发生淋巴结微转移时，5年生存率明显降低[２，３]。而对于胃癌病人区域淋巴结的微转移是否具有判断病人预后的意义尚存在争议。
近年来的研究证实：在早期及进展期胃癌病人的淋巴结中，可能存在孤立的癌细胞或小簇癌细胞团，这些癌细胞很可能影响病人的预后，而且淋巴结微转移可能是独立的预后因子之一[４]。SLC具有多种抗肿瘤特性并在胃癌淋巴管受侵和淋巴结转移中可能起了重要作用[5]；另一方面是由于淋巴管受侵可能是早期癌症淋巴结转移的重要预测因子。我们的资料发现：在35例胃癌病人中，14例病人淋巴结HE常规染色检测阴性，而免疫组化染色发现有隐匿性肿瘤细胞，即微转移1存在；而且，14例免疫组化染色阴性，而SLCmRNA显示有表达明显减弱的迹象，提示有可能存在隐匿的肿瘤细胞，即微转移2。这一结果也许可以解释为什么HE常规染色和免疫组化染色均显示淋巴结转移阴性的病人仍然会死于肿瘤复发的原因。
淋巴结转移的主要危险因素通常包括：原发肿瘤的大小、肿瘤的生长方式以及肿瘤的分化程度和浸润深度。我们资料显示：一般浸润性生长的肿瘤较膨胀性生长的肿瘤更易发生微转移；肿瘤浸润至浆膜下层时微转移发生率较肿瘤局限在肌层内时多见，但差异无显著性。
许多报道了胃癌病人存在着淋巴结的微转移，但对于预后意义的观点不一。多数研究为小样本量的回顾性分析，而T3、T4期肿瘤常见的复发形式是腹膜种植，如果样本中含有局部进展期肿瘤，则腹膜复发会干扰淋巴结微转移对预后的意义。大样本量的多因素分析或许能说明淋巴结微转移的作用，但淋巴结微转移与腹膜种植之间的明显关系同样会干扰多因素分析的结果。我们以PT0~3N0~2M0期的胃癌病人作为研究对象，从而有利于对淋巴结微转移的预后意义作出更准确的判断。
有研究发现，胃癌淋巴结微转移病人的5年生存率明显低于无淋巴结微转移者；多变量生存分析也表明淋巴结隐匿性癌细胞的存在可能是一个独立的预后因子[４]。在检测方法中，不易检测淋巴结微转移显然是传统HE染色的缺陷，抗细胞角蛋白单克隆抗体CAM5.2 的免疫染色被认为是检测淋巴结内孤立或小簇肿瘤细胞的有效方法。然而，上述方法依然不能预测淋巴结是否可能已经存在微转移，且用不同的抗体免疫组化检测淋巴结微转移，结果可能出现差异[6]。Sotiriou等[７]研究表明对乳腺癌组织的癌基因表达进行测定有可能增强肿瘤分级的准确性，提高其诊断价值；国内学者的研究也证实运用RT?鄄PCR法检测某些癌基因来推断淋巴结的微转移，其准确性高于免疫组化检测法[8]。
我们实验结果显示，胃癌病人联合SLCmRNA等分子生物学、免疫组化染色能检测出HE染色阴性淋巴结中隐匿的癌细胞，并且有淋巴结微转移的病人术后复发的概率较无淋巴结微转移的病人更大,提示联合分子生物学和细胞角蛋白免疫组化染色有助于发现常规HE检测阴性的淋巴结中可能存在的微转移。
【文献】
[1] Reape TJ, Rayner K, Manning CD, et al. Expression and cellular, localization of the CC chemokines PARC and ELC in human atherosclerotic plaques[J]. Am J Pathol, 1999,154(2):365-374.
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[3] des Guetz G,Lacortes JM,Camilleri?鄄Broet S, et al． Micrometastases in colonic cancers: diagnostic methods and prognostic elements[J]． J Chir (Paris), 2002, 139(3):141-148.
[4] Nakamura Y, Yasuoka H, Tsujimoto M, et al. Importance of lymph vessels in gastric cancer: a prognostic indicator in general and a predictor for lymph node metastasis in early stage cancer[J]. J Clin Pathol, 2006, 59(1):77-82.
[5] 贾忠, 封光华, 沈伟敏, 等. 次级淋巴组织因子在胃癌和转移淋巴结中的表达及其意义[J]. 中华普通外科杂志, 2003, 18（3）：156-158.
[6] 王贵英, 王士杰, 李勇, 等. 胃癌淋巴结微转移的多种抗体联合检测及其临床价值[J]. 癌症, 2004, 23（5）：559-563.
[7] Sotiriou C, Wirapati P, Loi S, et al. Gene expression profiling in breast cancr: understanding the molecular basis of histologic grade to improve prognosis[J]. J Natl Cancer Inst, 2006,98(4):262-272.
[8] 肖卫东, 王梦龙, 邹叶青, 等. 免疫组化合RT?鄄PCR法检测胃癌淋巴结微转移[J]. 江西医学院学报, 2002, 42（4）：1-3.
