心肌细胞条件培养液对鼻咽癌细胞生长抑制作用体外实验研究

           作者：崔艳慧　梁海军　吴敬波　任培蓉　张建文 

【摘要】  　　［目的］ 探讨心肌微环境因素对高转移潜能鼻咽癌细胞的影响。［方法］ 原代培养新生Wistar大鼠心肌细胞，用MTT法比较心肌细胞条件性上清液（CMCM）对高转移潜能鼻咽癌细胞的体外抑制作用。以顺铂作为CMCM的阳性对照，以正常细胞鼠肾小球系膜细胞作为鼻咽癌细胞的阴性对照。［结果］ 鼻咽癌细胞与不同浓度的CMCM共同培养后，细胞存活率明显下降（P<0.05），而对正常细胞鼠肾小球系膜细胞存活率无明显影响（P＞0.05）。［结论］ 新生大鼠心肌细胞条件培养液可选择性地抑制鼻咽癌细胞的增殖。

【关键词】  心肌细胞　条件培养液　鼻咽癌细胞　Wistar大鼠

　　An Experimental Research on Inhibitory Effect of Cardiac Muscle Cells Condition Medium on Nasopharyngeal Carcinoma Cells in Vitro

        Abstract: ［Purpose］ To explore  the effect of organic microenvironment of cardiac muscle on the nasopharyngeal carcinoma cell with high metastases potential. ［Methods］ Primary culture of newborn Wistar rat cardiac muscle cells was established, and the murine cardiac muscle conditioned medium(CMCM) was prepared to test its effect in vitro on nasopharyngeal carcinoma cells by MTT assay with cisplatin as positive control for CMCM and benign cells (murine mesangial cells) as negative control for nasopharyngeal  carcinoma cells. ［Results］ Proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells was significantly restrained when cultured with CMCM in various concentration（P<0.05）,while murine mesangial cells were not affected（P＞0.05）. ［Conclusion］ The conditioned medium of newborn rat cardiac muscle cells can selectively inhibit the proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells.

    Key words: cardiac muscle cell; conditioned medium; nasopharyngeal carcinoma cells; Wistar rat

    就会进入血液，由血液及淋巴循环的肿瘤细胞经静脉到心脏，而心脏的转移瘤却很少见。有报道尸检3 327例晚期恶性肿瘤病人，心肌受累者为1.7%[1]，哈尔滨医科大学1978年~1998年恶性肿瘤938例尸检报告，其中心脏转移88例，心肌转移34例，仅占3.6％[2]。且当心脏出现转移瘤时肿瘤大多已发生广泛转移，很少只累及心脏。关于出现该现象的原因，目前国内外尚无满意的研究结论，心肌微环境中是否存在着可溶性因子？基于临床上心肌转移瘤罕见的现象，本实验通过研究体外新生Wistar大鼠心肌细胞条件培养液体外对鼻咽癌细胞增殖的影响，探讨心肌微环境因素对鼻咽癌细胞生长的抑制作用及心肌转移瘤罕见的可能原因。

    1   材料与方法

    1.1   材   料

    Wistar大鼠购自泸州医学院动物中心；CNE-2购自中山医科大学细胞库；正常肾小球系膜细胞MCs由泸州医学院传染免疫室提供；酶联免疫检测仪 (EXL 美国)；0.25％胰蛋白酶（泸州医学院附属传染免疫室提供）；0.1%胶原酶（Sigma，北京华美公司提供）；MTT（北京华美公司）；底物溶液DAB试剂盒 (北京中杉金桥生物技术有限公司)；ABC试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；小鼠抗大鼠横纹肌单克隆肌动蛋白抗体Mouse Anti-Sarcomeric Actin 5C5；IgM (武汉博士德试剂有限公司)。

    1.2   CMCM的制备

    选用24~72小时新生Wistar大鼠，断颈法处死，剪取心脏，分离、收集心肌细胞，培养于含20％小牛血清的DMEM培养液。细胞呈对数生长期时更换新鲜DMEM培养液，继续培养24小时，收集上清液即CMCM。细胞鉴定采用小鼠抗大鼠横纹肌单克隆肌动蛋白抗体α-actin。

    1.3   细胞培养

    ⑴鼻咽癌细胞（CNE2）和肾小球系膜细胞（MCs）均用含10％的小牛血清的DMEM培养，取对数生长期的细胞进行实验。

    ⑵培养液处理：适量的心肌细胞培养液置100℃恒温水浴锅中10min，获热灭活之培养液。适量的心肌细胞培养液中加入胰蛋白酶，终浓度为0.01％，在37℃培养箱中消化30min，获得胰蛋白酶消化之心肌细胞培养液。

    1.4   实验方法

    用96孔培养板培养细胞，每孔接种细胞数约为2×104。各细胞分别与CMCM原液、热灭活之培养液及其胰蛋白酶消化之心肌细胞培养液共同培养48小时后，参照Mosmann[3]的四唑盐（MTT）比色法，在酶联免疫检测仪上选择490nm波长，测定各孔的光吸收值(A值)，将顺铂（6.67μg/ml）分别与各细胞株共培养，作为CMCM的阳性对照；以DMEM为空白对照，每组实验重复3次。根据公式：细胞存活率=（试验组光吸收值/对照组光吸收值）×100%，将光吸收值转换成细胞存活率。

    1.5   统计学处理

    结果以x±s表示，采用统计软件SPSS11.5，进行单因素方差分析（F检验）。

    2   结   果

    2.1   CMCM对正常非肿瘤细胞肾小球系膜细胞和

    肿瘤细胞CNE2影响

    化疗药物DDP对正常非肿瘤细胞肾小球系膜细胞和肿瘤细胞CNE2均有显著的抑制作用（P<0.01），CMCM对非肿瘤细胞肾小球系膜细胞无显著的抑制作用（P=0.763）。相反在一定程度上有促进生长作用（P<0.05）。而CMCM各稀释点对高转移性鼻咽癌细胞CNE2有显著的抑制作用，与DMEM相比差异具有显著性（P<0.05）。

    2.2   不同心肌细胞培养液原液对鼻咽癌存活率的影响

    心肌细胞培养液原液经过化学处理（胰蛋白酶消化，CMCM1）后仍保留原培养液生物活性，对鼻咽癌细胞仍有明显抑制作用，与DMEM相比差异具有显著性（P＜0.01），心肌细胞培养液原液经过物理处理（热灭活，CMCM2）后原培养液生物活性消失，对鼻咽癌细胞无明显抑制作用，与DMEM相比差异无显著性（P=0.253，P=0.03）。

    3   讨   论

    肿瘤转移的发生不是随机的，不同脏器发生转移的概率各不相同，如肺、肝、肾上腺最易出现转移灶，相反，有的脏器尽管有丰富的淋巴、血管，却很少发生转移，如肾脏、横纹肌、甲状腺虽然接受近人体1/4的全身血液，但却很少成为转移的部位。这种现象可能与肿瘤细胞的生物学特性、器官组织结构、血流、生化环境（氧化、营养）、受压及手术状况以及宿主的局部防御功能有关。转移的形成有赖于肿瘤细胞的生物学特性、器官组织的微环境和器官组织对转移瘤细胞的调控作用。但在肿瘤转移机制的研究中，人们普遍关注的是转移过程中肿瘤细胞本身的变化，以及其与靶器官微环境之间的相互作用和相互影响，很少有人注意到那些转移瘤罕见出现的器官的微环境对肿瘤的负面影响，进而从这一相反的角度深入研究肿瘤转移的机制。据报道，一些器官可分泌某些因子吸引肿瘤细胞，并促进其增殖和生长。而另一些器官可分泌某种可溶性因子，抑制肿瘤细胞的增长[4]。Djaldetti等[5~7]在骨骼肌条件培养液中（MMCM）中检测到低分子抑瘤活性物质，认为这可能是骨骼肌抵御转移瘤形成的机制。罗成华[8，9]又进一步观察了骨骼肌细胞条件培养液体外对不同来源和种系的肿瘤细胞增殖的影响，表明新生鼠的骨骼肌细胞可产生特异性抑制人及哺乳动物肿瘤增殖的抑瘤物质，其分子量≤10 000，对热不稳定而对胰蛋白酶稳定，其抑瘤活性系通过直接损伤肿瘤细胞膜而非导致瘤细胞凋亡实现的。

    我们通过心肌细胞培养液培养恶性肿瘤细胞，即具有高转移潜能的鼻咽癌细胞，模拟心肌的微环境，避开内皮细胞和细胞外基质ECM的影响，直接观察器官实质细胞心肌细胞对肿瘤的影响，分析临床所观察到的心肌内罕见转移瘤的可能机制。实验表明鼻咽癌细胞在心肌细胞培养液中培养后细胞存活率明显下降，心肌细胞培养液原液经过化学处理后仍保留原培养液生物活性，对鼻咽癌细胞有明显抑制作用。心肌细胞培养液原液经过物理处理生物活性消失，对鼻咽癌细胞无明显抑制作用。对非肿瘤正常的细胞无抑制作用反而在一定程度上有促进生长的作用。而DDP对肿瘤细胞和正常非肿瘤细胞均有显著的抑制作用。由此推测心肌细胞培养液可能含有一种或几种抑瘤物质，这种物质具有选择性的抑瘤作用 ，其作用机制不同于化疗药物DDP。

    由此可见，心肌的微环境中可能存在某种抑瘤物质，其是心肌转移瘤罕见性的主要机制。因此，我们将对CMCM中抑瘤物质的活性成分进行分离，并对其抑瘤机制、理化特性以及体内抑瘤效应进行深入研究，以便更进一步认识恶性肿瘤的转移。

【】
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[2] 周少甫, 张月顺, 孟子敏. 心血管转移性恶性肿瘤125例分析[J]. 人民军医, 2000, 43（3）：149-150.

[3] 司徒镇强, 吴军正. 细胞培养[M]. 西安：世界图书出版社西安公司, 2001. 138-138.

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[5] Djaldetti M,Sredni B, Zigelman R, et al. Muscle cells produce a low molecular weight factor with anti-cancer activity[J]. Clin Exp Metastasis, 1996, 14(3):189-196.

[6] Fishman P, Bar-Yehuda S, Vagman L. Adenosine and other low molecular weight factors released by muscle cells inhibit tumor cell growth[J]. Cancer Res,1998,58(14):3181-3187.

[7] Bar-Yehuda S, Farbstein T, Barer F, et al. Oral administration of muscle derived small molecules inhibits tumor spread while promoting normal cell growth in mice[J]. Clin Exp Metastasis, 1999, 17(6):531-535.

[8] 罗成华, 蒋彦永, 李向红, 等. 骨骼肌转移瘤的罕见性及骨骼肌微血管内皮细胞粘附分子意义的研究[J]. 军医进修学院学报, 2000, 21(1)：8－10.

[9] 周乃康, 郑梦利, 罗成华, 等. 骨骼肌条件培养液对肺癌细胞生长抑制作用的实验研究[J]. 癌症, 2003, 22(3):274-276.