结肠癌原发灶及其淋巴结转移灶中E钙粘素和β连环素表达

            作者：谷彦军　张诗武　宋立新　魏焕萍　刘亚敏　何瑞波

【摘要】  　　［目的］ 探讨结肠癌原发灶及其淋巴结转移灶中E钙粘素（E-cad）和β连环素（β-cat）表达的临床意义。［方法］ 采用组织芯片技术，应用免疫组化方法检测81例结肠癌原发灶及其淋巴结转移灶组织中E-cad和β-cat的表达。［结果］ 原发灶及其淋巴结转移灶中β-cat的正常表达率分别为23.46%和4.94%，原发灶中显著高于转移灶(P<0.01)，尤其是高中分化病例，转移灶中异位表达率显著高于原发灶 (45.68%比28.40%，P<0.01)，尤其是管状腺癌；原发灶中β-cat表达强度显著高于转移灶(P<0.01)。E-cad的表达强度在原发灶显著高于转移灶(P<0.01)，尤其是管状腺癌和高中分化病例。［结论］ 低表达E-cad和β-cat及异位表达β-cat的结肠癌细胞可能具有较强的转移能力，更易于发生淋巴道转移。

【关键词】  结肠肿瘤　E钙粘素　β连环素　组织芯片　免疫组织化学

　　 Expression of E-cadherin and β-catenin in Primary Lesion with Colon Carcinoma and the Metastatic Lymphonodes 

        Abstract: ［Purpose］To explore the clinical significance of expression of E-cadherin and β-catenin in both primary lesion with colon carcinoma and the metastatic lymphonodes. ［Methods］ Immunohistochemical staining of E-cadherin and β-catenin with tissue microarrays was carried out in 81 cases with colorectal carcinoma, including primary lesion and the metastatic lymphonodes. ［Results］ Expression rate of β-catenin in primary lesion and metastatic nodes was 23.46% and 4.94%, respectively. The rate in metastatic lesion was significantly lower than that in primary lesion (P<0.01), especially that in well and moderately differentiated carcinoma. The extopic expression rate in metastatic carcinoma was significantly higher than that in primary lesion(45.68% vs. 28.40%,P<0.01)，especially in tubiform adenocarcinoma. Expression of β-catenin in metastatic carcinomas was significantly lower than that in primary colon carcinomas (P<0.01). Expression of E-cadherin in metastatic carcinoma was significantly lower than that in primary colon carcinoma(P<0.01)，especially in tubiform adenocarcinoma and well and moderately differentiated carcinoma. ［Conclusions］ Colon cancer cells with low expression of E-cadherin and β-catenin, and extopic expression of β-catenin are more invasive and likely to lymphonglaudula metastasis..

    Key words: colon neoplasms; E-cadherin; β-catenin; tissue microarray; immunohistochemistry  

    恶性肿瘤局部浸润和远处转移与细胞间粘附力的降低有关，其中E钙粘素(E-cadherin，E-cad)和β连环素(β-catenin，β-cat) 传导通路具有重要作用。研究发现两者在结肠癌中常出现表达异常，但目前未见关于结肠癌原发灶及其淋巴结转移灶中两者表达关系的报道。本文应用组织芯片技术，免疫组化方法，检测81例结肠癌及其淋巴结转移灶中E-cad和β-cat表达，探讨其表达在结肠癌淋巴转移中作用。

    1   材料与方法

    1.1   材   料　

    收集天津肿瘤1987~2002年间存档的常规石蜡包埋的具有淋巴结转移的结肠癌组织标本共81例。其中男性41例，女性40例；管状腺癌63例和黏液腺癌18例；高中分化40例，低分化4例；有随访资料者47例。年龄26~77岁，中位年龄48岁。所有患者术前均未接受任何辅助。其中行单纯手术治疗者41例，行手术加化疗者25例，行手术加放疗者11例，行手术加化疗、放疗者4例。每例石蜡标本4μm厚连续切片，用HE染色。

    1.2   方   法　

    将这81 例结肠癌原发灶及其有淋巴结转移的组织蜡块重新切片，进行复习并确诊。为了实验研究的方便和减小定位误差，根据HE 切片，我们对石蜡标本中有代表性的点进行标记，根据标记好的点将这81例结肠癌及其淋巴结转移灶的石蜡标本制作成2个组织芯片。为了防止在打点、切片、染色或免疫组化过程中出现漏点、滑片及掉片现象，每个样本我们均上样两个点。

    采用免疫组化SP法在组织芯片上进行E-cad和β-cat染色。鼠抗人E-cad和β-cat抗体和SP试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。

    免疫组化采用专用微波炉进行抗原微波热修复，严格按SP 法操作流程染色。全程实验用已知的阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

    1.3   结果判定　

    E-cad表达于细胞膜，其标记阳性细胞表现为细胞膜呈棕黄色颗粒着色。

    β-cat的表达分别从细胞膜、细胞浆、细胞核三个方面判断，只有胞膜棕黄色颗粒着色者为阳性细胞，而细胞质或细胞核呈棕黄色颗粒着色者为异位表达细胞。

    1.4   结果记录　

    根据Ropponen 等[1]介绍的方法对E-cad和β-cat表达强度进行半定量分类，β-cat的异位表达细胞视为阴性表达细胞。在目镜中装入100目测微网格（Olympus），400×镜下，每个点阵计数1 000个肿瘤细胞，E-cad或β-cat阳性细胞百分比。

    各病例两组表达强度的判断标准为：阳性细胞>90%者为正常表达(++)，10%~90%者为表达减弱(+)，<10%或完全消失者为阴性表达(-)。

    因为β-cat存在异位表达，计数其发生异位表达的例数，计算异位表达率。

    1.5   统计学处理　

    用SPSS10.0 统计软件包进行统计学分析。采用四格表资料的χ2检验进行两组间率的比较；采用两样本资料或配对资料秩和检验进行E-cad和β-cat表达强度的比较。

    2   结   果

    2.1   E-cad和β-cat在结肠癌原发灶及其淋巴结

    转移灶中的表达

    所选81例结肠癌原发灶及其淋巴结转移灶中E-cad表达均表现为表达减弱或阴性表达，但其表达强度明显不同，原发灶中显著高于转移灶(P<0.01)，其中6例表现为转移灶中表达强度高于原发灶，见表1。

    所选81例结肠癌原发灶及其淋巴结转移灶中均可见β-cat正常表达病例，β-cat可异位表达于细胞质和细胞核，尤其是细胞核。原发灶及其淋巴结转移灶中β-cat的正常表达率则分别为23.46%(19/81)和4.94%(4/81)，原发灶显著高于转移灶(χ2=11.40，P<0.01)；异位表达率分别为28.40%(23/81)和45.68%(37/81)，转移灶显著高于原发灶 (χ2＝5.19，P<0.01)；原发灶中β-cat表达强度显著高于转移灶(P<0.01)，其中11例表现为转移灶的表达强度高于原发灶，见表1。

    2.2   E-cad和β-cat在结肠癌原发灶及其淋巴结

    转移灶中的表达与临床病理特征关系

    所选81例病例中管状腺癌63例，黏液腺癌18例。原发灶中E-cad表达强度在管状腺癌明显高于黏液腺癌(χ2=4.21，P<0.01)，而转移灶中E-cad表达与组织学类型无关。原发灶及其淋巴结转移灶中β-cat的表达强度、正常表达率及异位表达率在管状腺癌和黏液腺癌中均差异无显著性。进一步分析不同组织学类型结肠癌原发灶和转移灶间两者的表达情况，结果显示：管状腺癌E-cad的表达强度在原发灶显著高于转移灶（Z＝-3.97，P<0.01），黏液腺癌中表达强度无明显不同；管状腺癌β-cat异位表达率在转移灶显著高于原发灶(χ2=34.16，P<0.01)，管状腺癌和黏液腺癌中β-cat的表达强度在原发灶均显著高于转移灶(Z值分别为-3.3和-2.28，P<0.05)，结果见表2和表3。

    所选81例病例中高中分化者40例，低分化者41例。原发灶中E-cad的表达强度在高中分化病例显著高于低分化病例(Z=-2.68，P<0.01)，转移灶中其表达与肿瘤分化程度无关。原发灶及其淋巴结转移灶中β-cat表达强度与肿瘤分化程度无关。进一步分析不同分化程度肿瘤原发灶和转移灶间两者的表达情况，结果显示：高中分化病例原发灶中E-cad表达强度显著高于转移灶（Z＝-3.13，P<0.01），低分化病例中原发灶和转移灶间E-cad表达强度差异无显著性；高中分化病例原发灶和转移灶中β-cat正常表达率分别为30%(12/40)和5.00%(2/40)，前者显著高于后者(χ2=8.66，P<0.01)，低分化病例中差异无显著性，高中分化病例和低分化病例中β-cat的表达强度在原发灶均显著高于转移灶（Z值分别为-2.38和-3.70，P＜0.05），结果见表2和表3。

    2.3   E-cad和β-cat在结肠癌原发灶及其淋巴结转移灶中表达与预后关系 

    所选81例病例中有完整随访资料者47例。47例中术后36个月内死于复发或转移者29例，死亡率61.70%，术后60个月内死亡者35例，死亡率为74.47%。原发灶中E-cad表达减弱及阴性表达者3年生存率分别为50.00%(14/28)和21.05%(4/19)，前者显著高于后者 (χ2=4.01，P<0.05)，手术加辅助者和单纯手术者5年生存率分别为45.00%(9/20)和11.11%(3/27)，前者显著高于后者(χ2=6.94，P<0.01)，而原发灶和转移灶中β-cat表达强度、肿瘤组织学类型、肿瘤分化程度及手术时年龄等不同因素的3年和5年生存率无显著性差异。

    3   讨   论

    E-cad是钙黏附蛋白分子家族中跨膜蛋白亚型的一种，其主要作用是通过与细胞表达的连环素如β-cat相互作用，介导细胞间的粘附，维持上皮细胞形态和结构完整。以前研究表明正常结肠黏膜上皮E-cad和β-cat均表达于胞膜，阳性细胞均>90%，为正常表达，而结肠癌组织却常出现两者的表达减弱或缺失, 并且E-cad表达与Dukes分期呈负相关，β-cat在蛋白水平可出现细胞质或细胞核内异位表达，基因水平则可发生基因突变[2，3]，但尚未见关于结肠癌原发灶及其淋巴结转移灶中两者表达关系的报道。

    本研究通过对81例结肠癌原发灶及其淋巴结转移灶中E-cad和β-cat表达情况的研究发现：E-cad全部表现为表达减弱或阴性表达，未见其正常表达者，与以前的研究结果相似，但值得注意的是本研究发现原发灶中E-cad的表达强度在管状腺癌显著高于黏液腺癌，并且管状腺癌和高中分化病例原发灶中E-cad表达强度均显著高于转移灶，而黏液腺癌和低分化病例中差异无显著性，表明发生转移的管状腺癌和高中分化癌细胞表达的E-cad显著减少，其表达下降或阴性表达可降低细胞间的粘附力，细胞易于弥散，而原发灶的黏液腺癌和低分化癌细胞则具有更强的转移能力，提示E-cad表达异常与结肠癌淋巴转移有关，尤其是管状腺癌和高中分化病例。以前研究表明与正常结肠黏膜上皮相比结肠癌中β-cat的表达明显减弱，本研究β-cat的正常表达率在原发灶仅为23.46%，但亦显著高于转移灶的4.94%，而异位表达率在原发灶中为28.40%，显著低于转移灶的45.68%，尤其是管状腺癌。进一步分析β-cat表达强度，结果发现管状腺癌、黏液腺癌、高中分化病例和低分化病例原发灶中其表达均显著高于转移灶，提示发生淋巴结转移的结肠癌细胞表达β-cat减少，并且这种改变与组织学类型和肿瘤分化程度无关，β-cat表达减弱是结肠癌发生淋巴道转移的原因之一。β-cat 作为一种细胞骨架蛋白，其作用与其细胞内存在状态有关。结合型通过与E-cad结合参与细胞间粘附作用，游离型（异位分布于细胞质和细胞核）则作为Wnt信号通路中的重要组成成分参与信号传导[4]，并且核异位表达的癌细胞增殖活性较高[5]。本研究发现转移的癌细胞β-cat的异位尤其是核异位表达明显增多，这些细胞是否同时具有较高的分裂增殖活性还有待于进一步研究证实。值得注意的是本研究发现E-cad和β-cat的表达强度分别有6例和11例表现为转移灶高于原发灶，这除了可能与样品的选取有关外，是否提示转移的癌细胞生物学行为不同与原发灶的癌细胞，出现了新的异质性。

    多种因素可影响结肠癌患者的预后，如Dukes分期[6]、黏附分子、APC基因异常[7]等。本研究结果表明手术加辅助治疗者5年生存率显著高于单纯手术者，原发灶中E-cad表达减弱者3年生存率显著高于阴性表达者，提示治疗方法及E-cad表达减弱与患者预后有关，而其它因素如肿瘤组织学类型、肿瘤分化程度及手术时年龄等的3年及5年生存率差异无显著性，这可能与所选病例均已有淋巴结转移、Dukes分期较单一有关，因为有研究证实在决定结肠癌预后的各种因素中，临床病理分期最为重要[6]。

    肿瘤细胞的浸润及转移能力与其多种分子表达异常有关。对比研究转移的肿瘤细胞和原发灶的肿瘤细胞有助于阐明其确切机制。本研究结果提示低表达E-cad和β-cat及出现β-cat异位表达的癌细胞可能具有较强的转移能力，更易于发生淋巴道或血道转移。

【】
  [1] Ropponen KM, Eskelinen MJ, Lipponen PK, et al. Reduced expression of alpha catenin is associated with poor prognosis in colorectal carcinoma[J]. J Clin Pathol, 1999, 52（1）:10-16.

[2] Iwamoto M, Ahnen DJ, Franklin WA, et al. Expression of beta-catenin and full-length APC protein in normal and neoplastic colonic tissues[J]. Carcinogenesis, 2000, 21(11):1935-1940.

[3] Yamada Y, Oyama T, Hirose Y, et al. Beta-Catenin mutation is selected during malignant transformation in colon carcinogenesis[J]. Carcinogenesis, 2003, 24(1):91-97.

[4] Resnik E. Beta-catenin——one player, two games[J]. Nat Genet, 1997, 16(1):9-11.

[5] Sellin JH, Umar S, Xiao J, et al. Increased beta-catenin expression and nuclear translocation accompany cellular hyperproliferation in vivo[J]. Cancer Res, 2001, 61(7):2899-2906.

[6] 刘天云,谭卫泽,郑核,等. 影响结肠癌手术预后的Ｃｏｘ回归分析[J]. 医学临床研究，　2004，21(11)：1274-1277.

[7] Stamos MJ.Colon and rectal surgery[J]. J Am Coll Surg, 1998, 186(2):134-140.