重组细小病毒对胶质瘤细胞的生长抑制作用

【摘要】  　　［目的］ 研究表达趋化因子MIP-1α/LD78β的重组细小病毒对胶质瘤细胞的生长抑制作用。［方法］ 共转染法制备重组病毒。用重组病毒感染人胶质瘤细胞系U87MG以及鼠胶质瘤细胞系GL261，监测细胞生长并用ELISA方法测定细胞培养上清中MIP-1α蛋白每日和累积表达量。克隆形成实验测定病毒的细胞毒性。［结果］ 与未处理的细胞相比，MOI=3 RU/cell的重组病毒感染使GL261细胞克隆形成减少。U87MG和GL261细胞感染重组病毒后均可产生大量MIP-1α蛋白。日表达量的高峰分别出现在感染后第3d和第4d。2×105的 GL261和U87MG细胞在感染（MOI=3）5d后累积蛋白表达量分别为780ng/ml 和250ng/ml。和对照相比，重组病毒感染的GL261细胞生长减慢，但表达MIP-1α或LD78β的重组病毒与不含外源基因的重组病毒感染GL261后，活细胞数目没有明显差异。U87MG对病毒的敏感性低于GL261，感染重组病毒的各组细胞生长比对照略缓慢。［结论］重组细小病毒在体外对U87MG和GL261胶质瘤细胞的生长有抑制作用，但转导外源基因MIP-1α/LD78β在体外对细胞生长无明显影响，抑制作用主要是由于病毒的细胞毒性引起。

【关键词】  重组细小病毒　胶质瘤细胞　细胞毒性　生长抑制

　　 Growth Inhibition of Glioma Cells after Infection with the Recombinant Pavoviruses

     恶性胶质母细胞瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，常规的方法远不能达到治疗要求。趋化因子可吸引免疫效应细胞至病灶部位，并激活机体免疫反应，可作为肿瘤基因治疗的侯选基因[1]。巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)属于CC趋化因子家族，其主要作用是吸引单核细胞、淋巴细胞、杀伤细胞（NK）等。LD78β是MIP-1α的异构体，趋化活性较MIP-1α强[2]。我们前期的研究表明人胶质瘤细胞系U87MG以及鼠胶质瘤细胞系GL261可作为细小病毒治疗胶质母细胞瘤的细胞模型进行深入研究[3]，本研究测定了表达MIP-1α/LD78β的重组细小病毒在体外对U87MG和 GL261的细胞毒性和生长抑制作用，并测定了外源蛋白在细胞中的表达量，为下一步在动物体内研究其抗肿瘤作用作准备。

    1   材料与方法

    1.1   材   料

    细胞系：人胶质瘤细胞系U87MG以及鼠胶质瘤细胞系GL261，指示细胞 NBE-324K 和A9为德国癌症研究中心肿瘤病毒学研究室赠送。

    MVM和H1重组病毒质粒hH1/MIP-1α，hH1/LD78β和hH1/Δ800，MVMp/MIP-α，MVMp/LD78β，MVMp/Δ80及包装质粒和野生型病毒：德国癌症研究中心肿瘤病毒学实验室Dr. Rommelaere赠送。其他细胞为本室保存。

    1．2   方   法

    1.2.1   细胞培养

    293T、GL261和U87MG细胞在含10%小牛血清、2mM L-谷氨酸和抗生素的DMEM中培养，A9和NBE-324K在10%小牛血清，2mM L-谷氨酸和抗生素的MEM中培养。培养条件为37℃，5% CO2，90%湿度。

    1.2.2   重组病毒制备

    培养1×108 293T细胞，磷酸钙法转染300μg H1( hH1/MIP-1α，hH1/LD78β和hH1/Δ800)和MVM重组病毒质粒，(MVMp/MIP-α，MVMp/LD78β，MVMp/Δ800)及其相应的600μg包装辅助质粒，72h时后收获细胞, 冻融法制备病毒粗提物，碘克沙醇（iodixanol）梯度离心纯化，病毒分别感染SV40转化的人胎肾细胞系NBE-324K和鼠成纤维细胞A9，用病毒DNA特异性探针杂交测定H1和MVM重组病毒的感染滴度（replication unit，RU/ml）。

    1.2.3   病毒感染和生长曲线

    感染的前一天在6cm细胞培养皿中培养2.5×105细胞，次日吸除培养液，加入0.4ml用不含血清的MEM稀释的病毒，病毒剂量为multiplicity of infection(MOI)=3，置于37℃，5% CO2，90%湿度孵箱，每隔10min轻轻摇动培养皿1次，以确保细胞与病毒的接触。1h后吸除病毒，加入4ml含10%血清的培养液培养5d，每天取出2盘细胞用台盼蓝染色计数，绘制生长曲线。

    1.2.4   克隆形成实验测定病毒的细胞毒性

    在6cm 细胞培养皿中培养2.5×105 GL261细胞，次日进行病毒感染，病毒剂量为MOI=3，感染1h后吸除病毒，加入4ml含10%血清的培养液培养4h，用胰酶消化细胞并计数，在新的培养皿中分别加入100、500、1000、2000、4000、10000个细胞/皿，培养2周，吸出培养液，4℃用乙醇/醋酸（3∶1）固定细胞20min，70%乙醇和清水洗涤，加结晶紫染色30min，清水洗涤后计细胞克隆数。

    1.2.5   趋化因子表达测定

    培养2.5×105 U87MG和GL261细胞，分别用MOI=3的重组H1和MVM病毒感染1h，继续培养5d，每天收集一盘细胞的培养上清，ELISA测定蛋白的累积表达量。日表达量的测定每天从同一盘细胞中收集培养液，并更换新培养液。

    2   结   果

    2.1   病毒制备

    收集感染了病毒3d后的293T细胞，37℃10min，－80℃30min反复冻融3次，离心收集上清为病毒粗提物，病毒粗提物用碘克沙醇梯度离心进行纯化后，感染A9（MVM病毒）和NBE-324K（H1病毒）细胞，48h后将细胞转移至硝酸纤维素膜上，经变性和中和后，用病毒基因组特异性NS探针杂交，测定病毒感染性滴度，得到感染滴度为9×106RU/ml~1×108RU/ml的重组病毒。

    2.2   病毒的细胞毒性

    由于U87MG细胞不形成克隆，因此仅测定了MVM重组病毒对GL261细胞的毒性。克隆形成实验结果表明，MOI=3 RU/cell的重组MVMp病毒减少GL261细胞克隆形成，MVMp/MIP-1α，MVMp/LD78β，MVMp/Δ800病毒感染细胞的克隆形成率与对照(视为100%)相比分别降至61%、76%和71%。含趋化因子的重组病毒与不含外源基因(Δ800)的病毒相比，对细胞的毒性没有差异。

    2.3   病毒感染后细胞生长曲线

    和对照相比，MVM重组病毒感染的GL261细胞生长减慢，但转导了外源基因MIP-1α和LD78β的重组病毒与不含外源基因（Δ800）的重组病毒相比，对细胞生长的影响无差异（图1），说明细胞生长的抑制主要是由于病毒的细胞毒性引起的，很可能是因为病毒产生毒性很强的NS蛋白造成的。U87MG对病毒的敏感性低于GL261，感染重组病毒的各组细胞生长比对照略有减少（图2）。

    2.4   外源基因在宿主细胞中的表达量

    用H1重组病毒感染人胶质瘤细胞系U87MG，用MVM重组病毒感染鼠胶质瘤细胞系GL261，ELISA方法测定细胞培养上清中趋化因子蛋白的含量。结果显示2×105细胞在感染（MOI=3）5d后 GL261和U87MG细胞培养上清蛋白量分别为780ng/ml和250ng/ml。GL261和U87MG细胞表达外源蛋白的高峰分别在感染后第4天和第3天。GL261细胞的表达量明显高于U87MG，而且在两种细胞中LD78β的表达量均比MIP-1α表达量高。见图3。

    3   讨   论

    为了研究趋化因子MIP-1α/LD78β的抗肿瘤作用，我们利用细小病毒载体转导MIP-1α/LD78β至脑胶质瘤细胞系U87MG和GL261，在体外测定了重组病毒的细胞毒性、对宿主细胞生长的影响以及外源基因在宿主细胞内的表达。

    GL261细胞克隆形成实验结果表明重组病毒在体外对细胞有毒性，和对照相比，病毒感染组的细胞克隆形成均减少。但含MIP-1α、LD78β的病毒和不含外源基因的病毒相比，三者的克隆形成率没有差异，提示病毒的细胞毒性与转导的外源基因没有关系。从细胞感染病毒以后的生长曲线也可以得出同样的结论。我们知道，细小病毒的非结构蛋白NS1是一个多功能的蛋白，具有解旋酶、核酸内切酶、ATP酶、DNA-nicking和序列特异性DNA结合活性，既可控制病毒DNA的复制和表达，还具有细胞毒性作用[4]。Geletneky等[5]报告细小病毒对恶性胶质瘤的毒性作用与病毒的复制和感染性病毒颗粒产生有关。Cornelis[6]的研究表明，病毒不经过完整的病毒复制周期也可产生细胞毒性作用，证实细小病毒的抑癌作用不仅可以通过病毒在肿瘤细胞中的大量复制溶解肿瘤，还可以通过产生毒性NS1蛋白发挥作用。而我们所用的重组病毒在细胞内不能复制，因此可以认为重组病毒对U87MG和GL261细胞生长的抑制主要是由于病毒产生毒性很强的NS1蛋白造成的。

    虽然细小病毒的宿主广泛，但不同细胞对病毒的敏感性有差异。我们的结果表明，U87MG对病毒的敏感性低于GL261，细胞感染病毒后生长比对照略有减少，这与我们以前的野生型病毒感染结果相似[3]。Cornelis等[7]的研究表明，成纤维细胞和上皮细胞对细小病毒H1感染的敏感性是不同的，其敏感性的差异是与病毒结构和非结构蛋白的转录水平相关，而与病毒的摄入、基因产物在细胞内的定位、病毒mRNA的稳定性、非结构蛋白NS1的磷酸化都没有关系。我们在实验中也发现U87MG和GL261中病毒NS基因在mRNA水平也有一定差异(结果未显示)。

    我们用H1重组病毒感染人胶质瘤细胞系U87MG，用MVM重组病毒感染鼠胶质瘤细胞系GL261，ELISA方法测定细胞培养上清中趋化因子蛋白的含量。结果显示GL261细胞表达外源基因的效率高于U87MG。而且外源基因在两种细胞中LD78β的表达量均比MIP-1α表达量高。我们用半定量PCR方法检测了两个基因在mRNA水平的表达量，得到同样的结果（未发表结果），提示表达量的差异有可能是两个基因在转录水平上细微差异造成的。

    本文的研究结果表明，重组细小病毒（MOI=3）感染2×105 GL261和U87MG细胞5d后，细胞培养上清累积外源蛋白量可分别达到780ng/ml和250ng/ml，GL261和U87MG细胞表达外源蛋白的高峰分别在感染后第4d和第3d，提示作为基因载体可在局部产生高浓度的趋化因子蛋白发挥作用，加之细小病毒又具有亲瘤特性，因此可吸引免疫细胞至感染的肿瘤局部发挥作用。结合细小病毒对细胞的毒性作用，含趋化因子MIP-1α/LD78β的重组细小病毒有望在动物体内发挥抗肿瘤作用。

【】
  　　　[1] Moehler MH, Zeidler M, Wilsberg V, et al. Parvovirus H-1-induced tumor cell death enhances human immune response in vitro via increased phagocytosis, maturation, and cross-presentation by dendritic cells[J]. Human Gene Ther, 2005, 16（8）:996-1005.

[2] Menten P, Wuyts A, Van Damme J. Macrophage inflammatory protein-1[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2002, 13(6):455-481.

[3] 李方, 王字玲. 脑胶质瘤细胞系对细小病毒MVM和H1易感性的研究[J]. 肿瘤, 2006, 15（7）：462-465.

[4] Rommelaere J, Cornelis JJ. Autonomous Parvoviruses[A]. Hernáiz Driever P, Rabkin SD, eds. Replication-Competent Viruses for Cancer Therapy. Monographs in Virology(Vol.22)[M]. Basel: Karger, 2001. 100-129.

[5] Geletneky K, Herrero Y Calle M, Rommelaere J, et al. Oncolytic potential of rodent parvoviruses for cancer therapy in humans: A brief review[J]. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health, 2005, 52(7-8):327-330.

[6] Cornelis JJ, Salome N, Dinsart C, et al. Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer?[J]. J Gene Med, 2004, 6(Suppl 1):S193-S202.

[7] Cornelis JJ, Chen YQ, Spruyt N, et al. Susceptibility of human cells to killing by the parvoviruses H-1 and minute virus of mice correlates with viral transcription[J]. J Virol, 1990, 64(6):2537-2544.