大肠癌组织中HSP27、bcl?2、p53和P?gp的表达及其意义
作者：蔡永清，郭建波，张跃伟，赵鲁笳
【摘要】 目的 探讨热休克蛋白27（Heat shock protein,HSP27）和bcl?2、p53、P?gp蛋白在大肠癌组织中的表达及其意义。方法 运用免疫组织化学SP法检测HSP27和bcl?2、p53、P?gp在72例大肠癌组织中的表达，并运用多因素COX比例风险模型分析患者的预后。结果 HSP27、bcl?2、p53和P?gp在大肠癌组织中的阳性表达率分别为69.44% (50/72)、54.17%(39/72)、59.72%(43/72)和40.28%(29/72)。HSP27在高分化腺癌组的表达率为84.85%，显著高于低分化组的28.57%（χ2=29.614,P=0.000），bcl?2、p53和P?gp在高分化腺癌组的表达率也高于低分化腺癌组，具有统计学意义（P<0.05）。HSP27与bcl?2及P?gp在大肠癌中的表达具有相关性（r=0.380,P=0.001；r=0.284，P=0.016）。COX回归分析提示HSP27表达与生存期呈负相关。结论 HSP27、bcl?2、p53和P?gp在大肠癌组织中呈高表达，提示与大肠癌耐药有关；联合检测对临床制定合理的化疗方案具有指导意义；HSP27可作为判断大肠癌预后的一个独立预测指标。
【关键词】 大肠癌 免疫组化 HSP27 bcl?2；p53；P?gp
Expression and Significance of HSP27 and bcl?2、p53、P?gp Protein in Colorectal Carcinoma
Key words：Colorectal carcinoma; Immunohistochemistry; HSP27; bcl?2; p53; P?gp
大肠癌的发病率和死亡率在全世界呈逐年上升趋势，目前大肠癌的依赖于手术切除结合化疗的综合治疗模式。但大部分患者就诊时已处于癌症中晚期，已失去手术机会或只能予以姑息性手术，因此，化疗成为中晚期大肠癌综合治疗的主要手段之一。但大肠癌的化疗敏感性极差，这与大肠癌细胞的多药耐药有密切关系。
体内外研究发现，肿瘤细胞多药耐药（Multidrug resistance,MDR）的机制十分复杂，目前研究认为大致分为：(1）药理耐药（Pharmacological resistance）；(2）生化耐药（Biochemical resistance）；(3）凋亡耐药（Apoptosis resistance）；(4）微环境耐药（Microenvironment resistance）。药理耐药和微环境耐药与药物及机体免疫状况密切相关，因此凋亡耐药和生化耐药成为国内外研究和探讨的热点。我们利用免疫组化法检测大肠癌组织中HSP27、bcl?2、p53和P?gp的表达，探讨它们的表达与大肠癌耐药的相关性，旨在为有效治疗这一肿瘤、判断预后提供一些理论依据。
1资料与方法
1.1标本来源
选自我院1990年7月1日～1999年6月30日均经病理确诊的大肠癌组织标本72例。男38例，女34例，年龄33～81岁，平均年龄65.6岁，中位年龄（62.7±0.25）岁。肿瘤发生部位：结肠癌39例，直肠癌33例。组织学分型：高分化腺癌33例，中分化腺癌25例，低分化腺癌14例。大体分型：浅表型2例，隆起型17例，溃疡型53例。临床分期根据1967年Turnbull改良的Duke′s分期法，A期2例，B期20例，C期36例，D期14例。患者术前未经新辅助放化疗，术后化疗时间不等。随访截止于2002年12月31日，生存期的是从手术日期到随访日期或由于复发、转移而死亡的日期，随访率为84.72%（61/ 72），中位生存时间为15.3个月。
1.2免疫组织化学染色
所有标本经10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片厚4μm，1张作HE染色，1张切片作免疫组化染色，微波抗原修复。鼠抗人bcl?2、p53、HSP27和P?gp单克隆抗体及SP试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司，操作步骤按照试剂盒说明进行。用已知阳性切片和TBS替代第一抗体分别作阳性和阴性对照，用Harris苏木素液复染。
1.3结果判断
阳性表达以细胞膜和（或）细胞质出现棕黄色染色或伴有胞核棕黄色颗粒为阳性细胞。有两位病理医生分别计数5个高倍视野或1 000个细胞。采用兼顾阳性染色的强度和阳性细胞数所占百分比的判断标准[1]。
1.4统计学处理
蛋白表达率采用χ2检验，蛋白表达的相关性采用Spearman 等级相关检验，多因素COX比例风险模型（Multivariatrive COX proportional hazards model） 分析各因素对生存期的影响，所有数据处理均采用 SPSS 11.5 进行运算。
2结果
2.1HSP27、bcl?2、p53及P?gp在大肠癌组织中的表达
癌组织HE染色可见癌细胞排列成管状，见图1。HSP27阳性表达棕黄色颗粒位于胞核和（或）胞质内，呈灶性或弥漫性分布，见图2A。癌组织与癌旁组织的HSP27表达率分别是69.44%(50/72)和18.75%(9/48)，二者差异有统计学意义(χ2=29.614,P=0.000)，见表1。
bcl?2阳性表达主要表现为胞膜染色，呈灶性分布，见图2B，在癌旁组织中阳性表达主要局限于腺窝底部，而表皮上皮细胞少有表达。bcl?2在癌组织与癌旁组织的表达率分别是54.17%(39/72)和20.83%(10/48)，二者差异有统计学意义（χ2=13.245,P=0.000）。bcl?2的阳性表达率与大肠癌患者的年龄、性别及分型之间无明显相关性（P＞0.05），见表1。
p53蛋白阳性表达主要见于细胞核，见图2C，同时可见大肠癌腺体的典型增生，部分细胞p53蛋白呈强阳性表达，见图3。p53表达率与大肠癌患者的年龄、性别、分型和临床分期之间均无明显相关性，见表1。
P?gp主要表达于癌细胞的细胞浆及细胞膜，其胞核被苏木素染成灰蓝色，见图2D。与其他临床病理参数也无相关性，见表1。
同时运用Spearman 等级相关分析提示：HSP27和bcl?2蛋白在大肠癌组织中表达呈正相关（r=0.380,P=0.001），HSP27和P?gp在大肠癌组织中表达呈正相关（r=0.284，P=0.016）。
2.2 生存分析
单因素COX模型分析年龄、性别、淋巴结转移、组织学分型、临床分期、HSP27、bcl?2、p53和P?gp对生存期的影响，表明HSP27、bcl?2及临床分期影响预后，均与生存期呈负相关。考虑各因素间的交互作用，将以上9个因素建立多因素COX比例风险模型，其中临床分期（Duke’s分期）、年龄、HSP27表达是相关的预后因素，年龄大、分期晚（即浸润深度深）、HSP27过表达生存期短，见表2。
3讨论
大肠癌细胞为获得生存，要对抗化疗药物的毒性作用，自身存在着十分复杂的耐药机制。此外，大肠癌细胞在化疗药物的打击下，经化疗药物的诱导还可产生多种耐药因素。因此，临床上出现的耐药表型是多种机制共同参与的结果。而凋亡耐药和生化耐药正是肿瘤细胞获得多药耐药性的重要机制之一。
热休克蛋白27（Heat shock protein ,HSP27）是热休克基因（HSG）编码的低分子量蛋白质之一。表1HSP27、bcl?2、 p53和P?gp在大肠癌组织中的表达注： *表示高分化与低分化比较，(1）HSP27表达：高分化vs 低分化：χ2=14.327,P=0.000；(2）bcl?2表达：高分化vs 低分化：χ2=5.771,P=0.016；(3）p53表达：高分化vs 低分化：χ2=4.714,P=0.030；(4）P?gp表达：高分化vs 低分化：χ2=9.580,P=0.002 表272例大肠癌单因素和多因素COX模型生存分析它具有保护细胞免受各种应激因素损伤的作用。有学者先用热休克方法诱导前列腺癌细胞产生HSPs(HSP27和HSP72)，再应用放线菌素等化学试剂和放射线诱导癌细胞凋亡，与对照组相比，HSPs组显著增强了肿瘤细胞抵抗上述细胞毒因素的促凋亡作用，表明HSPs对肿瘤细胞凋亡有抑制作用[2]。Moret等[3]研究发现， HSP27高表达能引起肿瘤细胞对柔红霉素，甲氨喋呤和长春新碱的耐药性，其机制可能与HSP27将抗癌药滞留于高尔基体内，使药物不能作用于靶位发挥作用有关。本实验中HSP27蛋白在大肠癌组织中的表达率为69.44%，与报道相近[4]。HSP27的表达与大肠癌的分化程度有关，高分化组明显高于低分化组，这与临床上低分化腺癌比高分化腺癌化疗敏感相符。同时HSP27的表达与患者的年龄、性别、Duke’s分期、淋巴结转移无关。单因素分析提示，HSP27阳性表达与大肠癌患者的生存期呈负相关。
bcl?2是目前公认的凋亡抑制基因，该基因可以广泛抑制各种刺激诱导的细胞凋亡。bcl?2过度表达可以抑制正常细胞或肿瘤细胞的凋亡，是一种新的耐药因素。体外研究表明，bcl?2过度表达可以导致多种化疗药物的耐受。Nooter等[5]在人前列腺癌、结肠癌等肿瘤中发现有bcl?2蛋白过表达，并发现过表达bcl?2的腺癌对化疗药物阿糖胞苷具有抗药性。我们实验结果显示，bcl?2在大肠癌组织中的表达率为54.17%，其中强阳性表达8例，与文献报道相一致。bcl?2的表达与患者的年龄、性别、Duke’s分期、淋巴结转移无关。同时bcl?2在高分化腺癌中的表达率明显高于低分化腺癌，同临床上低分化腺癌比高分化腺癌化疗敏感相一致，提示bcl?2的过表达与肿瘤细胞耐药性相关。单因素分析bcl?2阳性表达的患者术后生存时间小于阴性表达者，表明bcl?2的表达影响大肠癌患者的生存期，推测bcl?2与化疗敏感性与疗效有关。
野生型p53（wtp53）基因是一种抗癌基因，具有增加细胞DNA修复能力和诱导凋亡从而促进受损细胞死亡的作用。但p53基因极易发生突变，突变后消除了许多依赖p53的反应，例如p53基因突变的肿瘤细胞株对凋亡的敏感性下降，从而产生耐受化疗药物的特性。Piperno等[6]研究发现，p53阳性的进展期直肠癌患者具有更短的生存期，多因素分析提示p53是一独立的预后不良因素。我们实验中p53基因产物在大肠癌组织中表达率为59.72%，其中过度表达18例，在高分化腺癌组阳性率高于低分化组，提示与耐药有关；且p53蛋白阳性表达患者的生存时间明显低于阴性表达者，提示p53的表达与生存期有关，考虑这与突变的p53过表达引发癌细胞对凋亡反应的阈值升高，从而耐受化疗有关。
P?糖蛋白（P?glucoprotein,P?gp）是Mdr1基因编码的一种跨膜糖蛋白，是目前认为最重要的耐药相关蛋白，通过ATP供能变构形成通道，主动将抗肿瘤药物泵至细胞外，使细胞内药物浓度下降形成耐药[7]。Goldstein采用免疫组化方法测定P?gp在大肠癌中表达范围在38%～96%之间。我们试验中P?gp在大肠癌组织中的表达率为40.28%，与文献报道相一致。P?gp的表达与大肠癌的分化程度有关，即高分化腺癌的表达水平明显高于低分化腺癌，此结果同临床上低分化腺癌比高分化腺癌化疗敏感相一致。而P?gp的表达与大肠癌患者的年龄、性别及淋巴结转移、分型均无关，说明P?gp阳性的大肠癌患者可因为肿瘤原发性耐药，使首次化疗失败导致肿瘤在短期内复发或转移而死亡。同时单因素分析提示P?gp阳性表达的患者术后平均生存时间小于阴性表达者。
肿瘤细胞产生耐药性是多方面的，它是多种作用机制协同、因果或同步作用的结果。生化耐药与凋亡耐药在肿瘤多药耐药（MDR）机制中发挥重要作用，我们实验结果提示，bcl?2和HSP27蛋白在大肠癌组织中的表达具有相关性（r=0.380,P=0.001），说明二者在细胞凋亡过程中可能发挥协同作用；同时HSP27和P?gp的表达也具有相关性（r=0.284，P=0.016），提示二者可能在大肠癌耐药过程中发挥协同作用。Kim等[8]研究发现逆转耐药药物quercetin通过抑制热休克因子DNA连接活性来降低P?gp的表达，间接说明HSP27的活性与P?gp的表达有关。而HSP27与p53表达无相关性。Bruey等[9]研究发现，HSP27与从线粒体释放的细胞色素C相结合，阻止细胞色素C与Apaf?1 和 procaspase?9的相互作用，从而干扰线粒体依赖的凋亡途径，而负面调控细胞的死亡。bcl?2是凋亡研究中最受重视的癌基因之一，研究发现，bcl?2可通过阻止胞质细胞色素C对procaspase蛋白酶的激活，而抑制细胞凋亡；因此二者可能在caspase蛋白酶水平发挥协同作用[10]。Guenal等[11]研究发现，bcl?2诱导的细胞凋亡与p53的诱导作用无关，而是与降低线粒体膜的电位和随后诱导的形态学改变有关，而且发现bcl?2和HSP27虽然在不同水平抑制细胞死亡，但是它们对细胞的保护作用具有部分重叠性，与我们实验结果一致。
Philip等[12]研究发现，HSP27在前列腺癌中的表达是一个独立而准确的预后因素。我们实验结果利用单因素COX模型分析，表明HSP27、bcl?2及临床分期影响预后，均与生存期呈负相关。同时利用多因素COX比例风险模型分析结果发现，临床分期（Duke’s分期）、年龄、HSP27是相关的预后因素，年龄大、分期晚（即浸润深度深）、HSP27高表达者生存期短。
我们实验结果表明，HSP27、bcl?2、p53和P?gp均与大肠癌细胞的多药耐药性密切相关，联合检测对于临床制定化疗方案具有指导作用；多因素分析提示HSP27可作为大肠癌判断预后的独立可监测因素，为临床判断预后提供了简单的观测指标，具有重要的临床意义。但由于样本例数较少，分析因素较多，可能会造成一些假阴性或假阳性结果，这有待通过扩大样本作进一步研究。
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