XPA基因多态性与食管癌、贲门癌发病风险的关联
【摘要】 目的 探讨XPA基因5’?非编码区转录启始密码子ATG上游第4位 A23G和228密码子G709A单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）与河北省食管癌、贲门癌高发区—磁县和涉县人群食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)和贲门腺癌(Gastric cardiac adenocarcinoma, GCA)遗传易感性的关系。方法 采用聚合酶链反应?限制性片段长度多态性(PCR?RFLP)分析方法检测327名ESCC患者、253名GCA患者和612名健康对照的XPA A23G 和G709A SNP的基因型。结果 XPA基因A23G的等位基因和基因型频率在ESCC和健康对照之间,总体分布有显著性差异。与A/A基因型相比, A/G+G/G基因型可显著降低ESCC的发病风险。分层分析显示，此保护作用在非吸烟组和吸烟组人群中尤为明显。此保护作用在UGIC家族史阴性人群中也很明显。在GCA和健康对照之间,A23G等位基因频率和基因型频率总体分布无显著性差异（P>0.05）。与A/A基因型相比, A/G+G/G基因型可显著降低GCA的发病风险。分层分析显示, 在非吸烟组中, GCA患者组和健康对照之间，基因型频率分布有显著性差异（P＜0.05）。与A/A基因型相比， A/G+G/G基因型可显著降低非吸烟人群GCA的发病风险。结论 XPA基因A23G 含突变等位基因（G）的基因型（A/G+G/G）可能是影响河北省食管癌、贲门癌的高发区——磁县和涉县人群ESCC发病风险的因素之一。
【关键词】 食管鳞状细胞癌 贲门腺癌 XPA 基因多态性
机体的DNA修复系统在维持基因组功能的整体性以及修复致癌因素所致的损伤中起重要作用[1] 。DNA 修复能力（DNA repair capacity, DRC）低下与癌症风险增高相关[2]。核苷酸切除修复（Nucleotide eacision repair, NER）是人类最主要和最灵活的的DNA损伤修复途径。
XPA是一种进化保守的DNA修复酶，在核苷酸切除修复通路中，它与RPA[3]、XPC、TFIIH、XPG、ERCC1?XPF复合体及DNA聚合酶一起共同作用,完成DNA的修复[4] 。XPA多态性的改变可能会影响其蛋白质的功能进而改变个体DNA的损伤修复能力。XPA多态性与肺癌相关研究已有报道[5,6]。但有关XPA多态性与食管癌和贲门癌关系的研究尚未见报道。
本研究应用聚合酶链反应?限制性片段长度多态性(Polymerase chain reaction?restriction fragment length polymorphism, PCR?RFLP)分析方法，探讨XPA基因多态性与河北省食管癌、贲门癌高发区—磁县和涉县人群食管鳞状细胞癌(ESCC)和贲门腺癌(GCA)遗传易感性的关系。
1 资料与方法
1.1 研究对象
327名食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)患者、253名贲门腺癌(Gastric cardiac adenocarcinoma，GCA)患者均来自河北省食管癌、贲门癌高发区磁县和涉县，612名健康对照为在相同地区相同时间体检为正常人群，并经本人知情同意，由专门的登记员调查所有研究对象的性别、年龄、吸烟史及上消化道肿瘤家族史。现吸烟或曾吸烟每天5支以上并持续两年或两年以上者定义为吸烟个体。家族中有1名以上一级亲属和(或)2名以上二级亲属患有食管癌/贲门癌/胃癌者定义为上消化道肿瘤（Upper gastrointestinal cancer, UGIC）家族史阳性。
1.2 标本采集及外周血白细胞DNA的提取
所有研究个体均采集静脉血5ml，经枸橼酸钠抗凝，4℃冰箱保存。采血后一周内，以蛋白酶K消化?饱和氯化钠盐析法，提取外周血淋巴细胞染色体DNA。
1.3 XPA SNP 基因分型
XPA A23G基因型检测应用PCR?RFLP方法进行。XPA基因A23G的 PCR反应体系为20μl，其中模板DNA 100ng，10×PCR缓冲液（MgCl2free）2μl， MgCl2 2.5mM，Taq DNA聚合酶（赛百胜公司，北京）2.0U，dNTPs 200μM，上游引物5’?TTAACTGCGCAGGCGCTCTCACTC?3’和下游引物5’?AAAGCCCCGTCGGC CGCCGCCAT?3’各200nM。PCR反应条件为：94℃预变性5min后， 94℃变性30s、58℃退火20s、72℃延伸20s，35个循环后，72℃继续延伸7min。PCR产物经限制性内切酶MspI（宝生物公司，大连）于37℃酶切16h后，进行4%琼脂糖凝胶电泳。A/A基因型由于缺乏MspI的识别位点保持原有PCR后的158bp的片段，而G/G基因型存在MspI的识别位点产生130和28bp两条DNA片段，A/G基因型则表现为158bp、130bp和28bp三条片段，见图1。
1: G/G genotype; 2、5:A/A genotype; 3、4、6、7: A/G genotype; 8: 100bp DNA marker
图1 XPA A23G 基因型分型
XPA G709A基因型检测应用PCR?RFLP方法进行。XPA基因G709A的 PCR反应体系为20μl，其中模板DNA100ng，10×PCR缓冲液（MgCl2 free）2μl，MgCl2 2.5mM ，Taq DNA聚合酶（赛百胜公司，北京）2.0U，dNTPs 200μM，上游引物5’?TTCATATGTCAGTTCATG?3’和下游引物5’?TTTTTCAGAATTGCGT?3’各200nM。PCR反应条件为：94℃预变性5min后， 94℃变性45s、50℃退火45s、72℃延伸45s，35个循环后，72℃继续延伸7min。PCR产物经限制性内切酶Taqa1（宝生物公司，大连）于65℃酶切16h后，进行4%琼脂糖凝胶电泳。G/G基因型存在Taqa1的识别位点产生130bp和18bp两条片段，而A/A基因型由于缺乏 Taqa1的识别位点保持原有PCR后的148bp的片段，G/A基因型则表现为148bp、130bp和18bp三条片段。
为进行基因型检测的质量控制，每一批PCR反应均以灭菌蒸馏水替代模板DNA作为阴性对照，XPA A23G随机挑取10%进行重复实验。
1.4 统计学方法
经卡方检验比较基因型频率的观察值与预期值，进行Hardy?Weinberg平衡分析。病例组和对照组的XPA基因型及等位基因型分布比较采用行×列表的卡方检验进行。应用非条件Logistic回归模型相对风险度的比值比（Odds ratio，OR）及其95%可信区间（Confidence interval，CI），以P<0.05定为有统计学意义。统计分析采用SPSS11.5软件包进行。
2 结果
2.1 一般特征
ESCC患者组、GCA患者组与对照组之间的性别、年龄构成相似（P>0.05）。ESCC患者组、GCA患者组中吸烟个体比例与对照组相比无显著性差异(χ2=0.50和3.35,P=0.48和0.07)。ESCC患者组、GCA患者组中UGIC家族史阳性个体比例分别为48.0%、47.8%，显著高于对照组34.2%（χ2分别为17.22和14.19，P值均为0.00），表明有UGIC家族史阳性可能是增加ESCC和GCA的发病风险的原因（经性别和年龄校正后的OR=1.76和1.77，95%CI=1.34～2.32和1.31～2.39），见表1。表1 食管癌、贲门癌和对照组人口学分布及XPA A23G等位基因型频率XPA G709A的SNP分析未成功分型。XPA A23G SNP分析成功进行了基因分型，重复分型结果均与原结果相符。经卡方检验，XPA A23G SNP基因型分布符合Hardy?Weinberg平衡(P>0.05)。
2.2 XPA 基因A23G SNP与ESCC、GCA的关系
2.2.1 XPA 基因A23G SNP与ESCC的关系
XPA基因A23G的等位基因频率在ESCC和健康对照之间,总体分布有显著性差异（χ2=6.39，P=0.01），见表1。XPA基因A23G的A/A、A/G、G/G基因型频率在健康对照组中分别为26.5%、52.6%和20.9%,在ESCC患者组中分别为37.6%、42.5%和19.9%,在ESCC和健康对照之间,其总体分布有显著性差异（χ2=13.27,P=0.00）。与A/A基因型相比, 携带G等位基因 (A/G+G/G基因型)，见表2。可显著降低ESCC的发病风险（经性别年龄校正后的OR=0.60,95%CI=0.45～0.80）。分层分析显示，在非吸烟组中，ESCC患者组与健康对照之间,基因型频率分布无显著性差异（P＞0.05）。但与A/A基因型相比,含G等位基因的基因型可降低非吸烟组ESCC的发病风险（经性别和年龄校正后的OR=0.64，95%CI=0.44～0.93）。在吸烟组中，ESCC患者组与健康对照之间,基因型频率分布有显著性差异（χ2=8.52,P=0.01），与A/A相比，含有G等位基因 (A/G+G/G基因型)可明显降低吸烟组ESCC的发病风险（经性别和年龄校正后的OR=0.54，95%CI=0.35～0.84）。在无UGIC家族史的ESCC患者与健康对照之间基因型频率总体分布有显著性差异（χ2=11.39,P=0.00）,此保护作用也很明显（经性别和年龄校正后的OR=0.54，95%CI=0.37～0.78）。而有UGIC家族史的ESCC患者组和健康对照之间，基因型频率分布无显著性差异（P＞0.05）。表2 XPA A23G基因型频率与ESCC、GCA发病风险的关系
2.2.2 XPA 基因A23G SNP与GCA的关系
XPA基因A23G的等位基因频率在GCA和健康对照之间,总体分布无显著性差异（P＞0.05）。在GCA患者组中XPA基因A23G的A/A、A/G、G/G基因型频率分别为34.0%、47.4%和18.6%,在GCA和健康对照之间,其总体分布无显著性差异 （P＞0.05）。然而，与A/A基因型相比, 含有G等位基因的 (A/G+G/G基因型)可降低ESCC的发病风险（经性别和年龄校正后的OR=0.70，95%CI=0.51～0.86）。分层分析显示, 在非吸烟组中,GCA患者组中XPA基因A23G的A/A、A/G和G/G基因型频率分别为32.6%、50.0%和17.4%,健康对照组分别为25.0%、53.4%和21.6%,基因型分布在两组之间有显著性差异（χ2=7.55,P=0.02）。与A/A相比，携带有G等位基因 (A/G+G/G基因型)可明显降低非吸烟组中GCA的发病风险（经性别和年龄校正后的OR=0.55，95%CI=0.36～0.85）。在无UGIC家族史和有UGIC家族史的GCA患者组和健康对照之间，基因型频率总体分布无显著性差异（P＞0.05）。表3 XPA A23G SNP与ESCC、GCA发病风险的相关性分析
3 讨论
DNA的损伤和基因结构异常、以及由此所造成的癌基因和抑癌基因表达或功能上的改变可能是细胞恶性转化的前提。由于细胞内DNA修复系统的存在，所以并非所有的损伤都会导致突变。如果DNA修复系统出现问题，细胞恶性转化的机率也会增加[7]。核苷酸切除修复（NER）途径是各种DNA损伤，如紫外线损伤和各种化学致癌物的加合物形成的损伤的主要修复通路[5]。XPA作为一种DNA损伤识别蛋白，在NER路径中起着至关重要的作用，它与受损的DNA结合，引发修复过程。缺失XPA基因的NER途径受损最重。
研究报道，XPA基因位于9号染色体（9q23.3），它的cDNA长1 377bp,可能包含有6个外显子，所编码的蛋白XPA 由273个氨基酸构成，相对分子量31 000kDa。XPA蛋白为一疏水性蛋白，存在于细胞核中。XPA 包括三个功能区，N端主要与复制蛋白A结合（Replication protein a，RPA），C端主要与转录因子IIH (Transcription fator IIH,TFIIH)结合并将其带到损伤位点;中心区198至219位氨基酸包含锌指结构，是与损伤DNA结合的功能区。Li等证实XPA蛋白可以与ERCC1以一种特定方式结合，他们认为XPA具有为切除修复复合体的ERCC1和其他因子到达DNA受损部位指示方向的功能。
XPA的多态性可能影响mRNA三级结构的稳定性或者影响转录因子与mRNA结合。在XPA基因的5’端非编码区，ATG起始密码子上游4个核苷酸处，存在A→G的多态[8,9]，XPA基因的5’非编码区可能是通过转录和后转录机制调节基因表达[10]，研究显示A到G的改变可以降低肺癌的发病风险。Park等[5]在对韩国一个小样本研究后得出，G/G基因型或G等位基因与肺癌有负性关联，特别在年轻、男性、吸烟人群中这种倾向更明显。在对高加索人、墨西哥人和美籍非洲人研究中，Wu等[6]得出含有G等位基因的基因型比A/A纯合型更能降低肺癌的发病风险，目前暴露于烟草致癌物的人群中这种倾向更明显。携带XPA 23G等位基因的个体，DNA修复能力高于携带A/A基因型者。我们在对食管鳞状细胞癌和贲门腺癌的研究中，也得出了类似的结论，携带有G等位基因(A/G+G/G基因型)可显著降低ESCC和GCA的发病风险。并且可显著降低非吸烟人群患GCA的发病风险。由于本研究是基于人群的病例对照研究，对照组和病例组的基因型分布均未偏离Hardy ? weinberg平衡，试验结果的重复性较好，因此可基本排除系统误差导致的基因型分布偏性。
但此类研究多为回顾性研究，且研究人群存在地域，人种和样本量的差异，因此有待于扩大样本量并在同种族，同地域人群中进行长期随访研究，并进一步观察XPA基因多态性与环境因素及其他遗传因素的相互作用，对揭示XPA基因多态性与肿瘤的确切关系有重要意义。
【】
［1］ 尹娇杨，李继承.DNA修复基因；核苷酸切除修复基因单核苷酸多态与癌症发生风险的研究进展/[J/].国外医学遗传学分册，2004，27（1）:23?26.
/[2/] Goode EL, Ulrich CM, Potter JD.Polymorphisms in DNA Repair Gene and Association with Cancer Risk /[J/]. Cancer Epidemiology Biomarkers &Prev,2002, 11（12）:1513?1530.
/[3/] Wakasugi M and Sancer A.Order of assembly of human DNA repair excision nuclease/[J/].J Biol Chem.1999,274（26）,18759?18768.
/[4/] Garry W,Buchko,Nancy J.Cadmium mutagenicity and human nucleotide excision repair protein XPA:CD,EXAFS and 1H/15N?NMR spectroscopic studies on the zinc(II)?and cadmium(II)?associated minimal DNA?binding domain (M98?F219). Carcinogenesis.2000,21(5):1051?1057.
/[5/] Park JY, Park SH, Choi JE, et al. Polymorphisms of the DNA repair gene xeroderma pigmentosum group A and risk of primary lung cancer /[J/]. Cancer Epidemiology Biomarkers &Prev,2002,11（10Pt1）,993?997.
/[6/] Wu X, Zhao H, Wei Q, et al. XPA polymorphisms associated with reduced lung cancer risk and a modulating effect on nucleotide excision repair capacity /[J/]. Carcinogenesis, 2003,24(3): 505?509.
/[7/] Ellen L Goode, Cornelia M Ulrich, John D Potter. Polymorphisms in DNA repair genes and associations with cancer risk/[J/]. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention,2002,11(12):1503?1530.
/[8/] Butkiewicz D,Rusin M,Harris C C, et al. Identification of four single nucleotide polymorphisms in DNA repair genes:XPA and XPB(ERCC3)in Polish population/[J/].Hum.Mutat,2000,15(6):577?578.
/[9/] Proter PC,Mellon I,States JC,XP?A polymorphism associated with reduced lung cancer risk and a modulating effect on nucleotide excision repair capacity /[J/].Carcinogenesis,2002,24(3):505?509.
/[10/]Larsen LK,Amri EZ,Mandrup 3,et al.Genomic organization of the mouse peroxisome proliferator activated receptor beta/delta gene.Alternative promoter usuage and splicing yield transcripts exhibiting differential translational efficiency/[J/].J Biochem,2002,366(Pt3):767?775.
