用基因芯片研究乙型肝炎病毒X蛋白羧基端缺失40个氨基酸差异表达基因
【摘要】 目的 用基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒X蛋白全长序列和X蛋白羧基端缺失40个氨基酸序列之间差异表达的基因，初步探索HBV相关的肝细胞癌发生的分子机制。方法 将20 228条 cDNA 用点样仪点在特制的玻片上制备成表达谱芯片，将带有乙型肝炎病毒HBx蛋白全长基因序列和HBx蛋白羧基端缺失40个氨基酸（HBx3’?40）基因序列的pcDNA3（?）的质粒分别转染肝癌细胞系Huh?7，提取两株细胞的总RNA，逆转录为cRNA，用Cys3和Cy5两种荧光分别标记，与表达谱芯片杂交，通过机扫描和数据处理，筛选出差异表达的基因。结果 差异表达的基因有167条，其中上调基因145条，下调基因22条，包括原癌及抑癌基因、细胞周期和细胞凋亡相关基因、信号转导和免疫调节相关基因、细胞增殖和代谢及基因转录等相关编码基因。结论 运用cDNA 表达谱芯片分析基因表达的差异, 能快速筛选出HBx和HBx3’?40之间差异表达的基因并高效率地对基因功能进行研究，为进一步研究HBV的致癌机制提供了理论依据。
【关键词】 cDNA芯片; 乙型肝炎X蛋白; 缺失; 基因; 差异表达
Identification of Differentially Expressed Genes in Hepatitis B Virus X Protein C?terminally Truncated 40 Amino Acids by cDNA Microarray
Abstract：Objective To investigate the differentially expressed genes of the full－length sequence of HBV X protein and the sequence of the HBV X protein deletion mutant c?terminally truncated 40 amino acids by cDNA microarray analysis and to evaluate the molecular biological mechanisms of the hepatitis B virus?mediated hepatocarcinogenesis. Methods Total RNAs were isolated from Huh?7 cells transfected with pcDNA3(?) integrated the sequcece of HBx protein c?terminally truncated 40 amino cids and pcDNA3(?) integrated the full length sequence of HBx protein vectors, then RNAs were reversely transcripted into cRNA and hybridized onto Agilent Genechip expression microarrays containing 20228 human cDNA. Analyses were performed to determine the different pattern of gene expression in the cells with full length HBx protein and HBx protein c?terminally truncated 40 amino acids and the changes in the expression level by computer. Results Through this cDNA microarray we identified 167 differentially expressed genes and among those we further identified 145 upregulated and 22 downregulated genes and two novel human genes, the existing genes including oncogenes and tumor suppression genes, cell cycle and cell apoptosis genes, signal transduction and immune regulation genes, cell proliferation and metabolism genes, and gene transcription?related genes. Conclusion Microarray technique is effective in screening the differentially expressed genes and exploring their function between two different kinds of Huh?7 cells transfected with pcDNA3?HBx and pcDNA3? HBx3’?40 respectively. To investigate those obtained genes will be helpful to understand the molecular mechanism of hepatoma associated with HBV infection.
Key words：cDNA microarray; Hepatitis B virus X protein; Deletion; Gene; Differential expression
0 引言
HBx蛋白是一种广泛的反式作用因子，对多种细胞与病毒的增强子及启动子有反式激活作用, 参与细胞信号传导和转录调控，与肝细胞癌的形成和密切相关［1］，大量研究表明，HBx蛋白存在不同程度的缺失和突变，并且发现HBx蛋白变异在肿瘤组织比非肿瘤组织更为常见［2］。阐明HBx蛋白在HBV相关的肝细胞癌发生发展中的作用，对于肝细胞癌的防治具有重要意义。本研究应用含有20 228条人类全长和非全长基因的cDNA表达谱芯片，对转染有HBx全长蛋白和HBx蛋白羧基端缺失40个氨基酸基因序列的二株细胞进行相关基因的筛查，寻找HBx蛋白反式激活基因及其与肝细胞癌发生的关系，为研究HBV相关的肝细胞癌的形成机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及材料
肝癌细胞株Huh?7(本室保存), HBx蛋白及HBx3’?40蛋白的真核表达质粒pcDNA3(?)由本室构建。RNeasy Mini Kit(Qiagen)，酶标仪（Gene Spec V）,Lipofectamine PLUS转染试剂盒(Gibco)。Cy5 NTP和Cy3 NTP（PerkinElmer），Gasket slide、Hybridization Chamber、Human oligo microarray均购自Agilent公司。
1.2 总RNA提取及检测
将生长至对数期的Huh?7细胞用脂质体转染试剂Lipofectamine PLUS分别转染pcDNA3(?)?HBx3’?40及pcDNA3(?)?HBx（分别标记为实验组和对照组），细胞收获经筛选鉴定后，用RNeasy Mini Kit试剂盒,提取转染了重组表达质粒Huh?7细胞的总RNA, 样品经QIAGEN RNeasyR Mini Kit（Affymetrix）纯化后用分光光度计检测吸光度,并用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量。
1.3 探针标记
将RNA逆转录为cDNA后，加入Cy3和Cy8制成cRNA探针并纯化。用Cy3?dUTP标记实验组细胞RNA，用Cy5?dUTP标记对照组细胞RNA。
1.4 芯片制备
cDNA表达谱芯片类型为AgilentG4110B，由上海生物芯片有限公司提供，包含20 034个人类基因cDNA,另外还设定了阳性对照114个，阴性对照20个，空白对照38个，内参照20个，每块芯片共计20 228个点。
1.5 杂交及洗涤
cRNA 探针经纯化和片段化后，与杂交缓冲液混匀，滴加在cDNA芯片上，盖上盖玻片置于杂交炉中，60℃滚动杂交16h。去掉盖玻片, 用SSPE和N?Lauroylsarcosine溶液洗涤1min×2, 然后用Stabilization and Drying Solution 溶液中洗30s，室温晾干。
1.6 检测与分析
芯片杂交结果采用Agilent 扫描仪进行扫描，Imagene软件读取数据。用Feature Extraction进行Normalize处理分析，最后用Ratio分析，Ratio值为cy3/cy5，即实验组/对照组。一般认为其值在0.5～2.0范围内的基因不存在显著的表达差异，而在该范围之外的基因则被认为表达出现显著改变。差异基因筛选标准为：ratio≥为上调基因，ratio0≤0.5为下调基因。
2 结果
2.1 总RNA的质量鉴定
提取转染了cDNA3(?)?HBx3’?40及 pcDNA3(?)?HBx细胞的总RNA，经1.0%琼脂糖凝胶电泳，可见18S和18S的清晰条带，并且28S条带的亮度和宽度为18S条带的2倍左右，见图1。紫外分光光度计检测，转染了缺失及全长HBx基因细胞的总RNA含量分别为4.66μｇ/μl和5.35μｇ/μl，吸光度A260/A280均大于1.90，说明所用总RNA的质量符合实验要求。
2.2 芯片杂交结果及分析
图2为转染了缺失及全长HBx基因细胞的cDNA表达双色荧光标记叠加图。实验组探针标记Cy3荧光素(呈红色),对照组探针标记Cy5荧光素(呈绿色),红绿颜色的差异就显示该基因在实验组和对照组中基因表达水平上的差异，黄色代表实验组与对照组细胞表达水平相当。图3为杂交信号强度散点图,每个点代表了芯片上一个基因点的杂交信号;红点代表Y值与X值的比值在0.5至2.0之间,为非差异表达，黄点代表Y值与X值的比值在0.5到2.0范围之外,为表达差异。根据差异基因的筛选标准,共得到差异表达的基因有167条，其中上调基因145条，下调基因22条。在上调基因中还发现了2条未知的基因。
2.3 差异表达基因的分析
通过对差异表达基因作BLAST分析，发现它们主要为已知基因，包括原癌基因及抑癌基因、细胞周期和细胞凋亡基因、与信号转导和免疫调节相关的基因、细胞增殖和代谢及基因转录等相关的编码基因等。另外还发现24个功能未知的基因。部分差异表达的基因有: ①与细胞生长调节相关的基因(如MAT2、SERPINB5和DHRS4L2)；②与细胞信号传导相关的基因（如PITPN1和WNT5A）；③与细胞凋亡相关的基因(如Caspase?6、 CLU、eIF5和HSP40);④癌基因（如ETV5、MYCBP2和c?myc）；⑤与细胞连接相关的基因（如LOC221091和MMP13）；⑥与细胞代谢相关的基因（如MTND2、CABC和FN3DRP），见表1。表1 部分差异表达基因的功能分析（略）
3 讨论
HBx基因编码的HBx蛋白是一种多功能蛋白，它通过与细胞/病毒的功能蛋白直接或间接地相互作用而调节多种蛋白的功能，具有广泛的反式激活作用。其结构有两部分组成，氨基端为其自身的调控区域，该区域能够抑制HBx蛋白的反式激活活性［3］，羧基端为其反式激活区域［4］，能够反式激活同源/异源的病毒/细胞转录调节序列,对乙型肝炎的慢性化和肝细胞癌的形成有密切关系［5］。
流行病学调查表明，在肝细胞癌(HCC)患者中常常检测到HBx蛋白读码框的突变和缺失，并且发现HBx蛋白不同区域的缺失和突变对其反式激活能力有不同的影响。HBx蛋白羧基端缺失不仅能够抑制HBx蛋白相关的促凋亡过程，而且还能加速细胞转化的进程［6］。刘晓红等［7］研究表明，HBx蛋白羧基端缺失20aa和40aa的突变体与全长的HBx蛋白相比，对肝癌细胞的增殖具有非常明显的促进作用。因此，HBx蛋白羧基端缺失突变体和全长的HBx蛋白在HBV相关的肝癌发生中可能起着不同的作用。为了探寻HBx蛋白羧基端缺失和全长的HBx蛋白在肝癌细胞中基因表达的变化，我们采用基因表达谱芯片技术筛选两株不同细胞的差异表达基因，对阐明HBV感染的慢性化和肝细胞癌的形成机制很有帮助。
在表1 的差异表达基因中,WNT5A为Wnt基因家族的成员之一，已证实Wnt信号传导通路与多种人类肿瘤的发生有密切相关。Wnt传导通路中的靶基因（原癌基因和抑癌基因等）发生突变或表达异常，或者其传导通路上成员（APC、 β?catenin、Axin、GSK3等）发生变异均可导致正常调控细胞增生的途径不恰当的活化，使细胞增生失控而导致肿瘤形成［8］。Ets基因家族是细胞内最大的信号依赖转录调控因子家族之一，其亚成员ETV5也参与了基因的转录调控。研究表明Ets家族中包含有与血管形成有关的激活因子与阻遏因子［9］。VEGF可诱导内皮细胞表达Ets基因,Ets基因表达产物又促使基底膜ECM分解，参与血管形成过程。因此某些Ets蛋白可促进肿瘤血管新生，进而促进肿瘤恶化。另外有资料表明，Ets蛋白在ECM的重建也能发挥作用，其主要参与ECM降解酶的转录激活相关的反应，促进肿瘤的浸润和转移［10］。与细胞连接有关的基因基质金属蛋白酶（MMPs）除通过降解基底膜和细胞外基质促进肿瘤细胞转移的作用外，还有促进肿瘤细胞生长和肿瘤血管形成的作用［11］。MMP13在基因表达谱中呈明显的上调表达。说明MMP13在肝细胞癌的侵袭和转移中可能发挥了重要作用。近年来发现，热休克蛋白（HSPs）在多种肿瘤细胞中呈过表达，与肿瘤的发生、发展有关。HSPs通过与抑凋亡基因如bcl?2和促凋亡基因如Fal、p53作用来调节肿瘤细胞的凋亡。在原发性肝癌中HSPs表现为过表达，其表达率与肿瘤细胞凋亡指数呈正相关［12］。本研究中HSP40基因在HBx3’?40组细胞基因表达谱中表现为上调，这也和该组细胞转染了HBx3’?40基因后其细胞增殖能力和促凋亡能力都增强相一致［12］。
【】
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