一种新的重组腺病毒载体pAdBM5?GFP?mAFP的构建

          作者：匡志鹏，谢裕安，梁安民，罗小玲，吴继宁

【摘要】  目的 构建表达小鼠甲胎蛋白（murine alpha fetoprotein，mAFP）基因的重组腺病毒载体pAdBM5?GFP?mAFP，并测定其滴度。方法 从Hepa1?6小鼠肝癌细胞中提取总RNA，设计特异性引物，通过RT?PCR法扩增mAFP基因，测序确认后,插入到pAdBM5?GFP穿梭载体中，双酶切鉴定重组腺病毒载体。线性化重组腺病毒载体与病毒骨架DNA质粒用磷酸钙共沉淀法共转染HEK293A细胞，通过同源重组使腺病毒表达mAFP基因，并在HEK293A细胞中大量扩增含目的基因的重组腺病毒，用TCID50法测定重组腺病毒滴度。结果 成功克隆了小鼠mAFP基因，构建出表达mAFP基因的重组腺病毒载体pAdBM5?GFP?mAFP，获得了表达mAFP基因的重组腺病毒，病毒滴度达3.2×108PFU／ml。结论 本研究成功构建了pAdBM5?GFP?mAFP载体，获得了高滴度表达mAFP基因的重组腺病毒，为进一步开展肝癌的免疫基因奠定了基础。

【关键词】  pAdBM5?GFP；小鼠甲胎蛋白；重组腺病毒载体

　　Abstract：Objective  To construct a novel recombinant adenovirus vector pAdBM5?GFP?mAFP and detect virus titer. Methods  Total RNA were extracted from hepa1?6 murine liver cancer cell line, mAFP(murine alpha fetoprotein，mAFP) gene was cloned by RT?PCR method. The gene was identified by sequencing, then it was inserted into pAdBM5?GFP shuttle vector by Bgl II and Pme I restrict enzyme digestion to construct pAdBM5?GFP?mAFP recombinant vector. mAFP gene was expressed in adenovirus by homologous recombinant in HEK293A cells after pAdBM5?GFP?mAFP vector and virus skeleton plasmid cotransfected HEK293A cells by standard calcium phosphate coprecipitation method. Virus titer was detected by TCID50 method. Results  pAdBM5?GFP?mAFP recombinant vector was successfully constructed and high titer recombinant adenovirus carrying mAFP gene was harvested. Virus titer reached to 3.2 108 PFU/ml. Conclusion  pAdBM5?GFP?mAFP recombinant adenoviral vector carrying mAFP gene was successfully constructed and high titer recombinant adenovirus was harvested. it will lay down the basis for further developing gene therapy of primary liver cancer.

　　Key words：pAdBM5；mAFP；Recombinant adenovirus vector

　　0  引言
   
　　大多数肝癌细胞过表达AFP抗原。Meng等［1,2］认为人甲胎蛋白是最重要的一种肝癌治疗性靶抗原。Vollmer 等［3,4］也发现尽管小鼠的免疫系统长期暴露于AFP环境中，当被合适地或特异性地激发时，仍能对这种胚胎性抗原产生较强的T细胞免疫反应。由此说明，AFP能够作为一种潜在的诱导特异性CTL反应的肿瘤抗原用于AFP分泌性肝癌的靶向性免疫治疗。因此，本研究将肝癌相对较为特异的甲胎蛋白（AFP）基因构建到含有强力启动子的pAdBM5腺病毒载体中，从而扩增出大量高效表达目的基因的重组腺病毒，为开展肝癌的靶向性免疫基因治疗完成关键的一步。

　　1  材料与方法

　　1.1  腺病毒和细胞株

    Hepal?6细胞为C57BL/6小鼠来源的肝癌细胞株，可分泌小鼠甲胎蛋白（mAFP），由第二军医大学王皓博士惠赠。HEK293A细胞、pAdBM5?GFP穿梭载体和腺病毒转染试剂盒购自Qbiogene公司。TOP 10感受态细胞购自北京天为时代科技有限公司。

　　1.2  主要试剂
       
　　DMEM培养基、胎牛血清(FBS)(GIBCO)，Trizol(Invitrogen)，M?MLV逆转录酶、pGM?T Easy载体和T Ligase（Promega），PyrobestTM DNA聚合酶（TaKaRa），Bgl II和Pme I内切酶（BioLabs）。 低熔点琼脂糖SeaplaqueR购自毕特博生物技术公司。质粒提取试剂盒，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自上海华舜生物科技公司。

　　1.3  方法

　　1.3.1  Hepal?6细胞的培养及总RNA的抽提

    采用DMEM培养液及10% FBS常规培养Hepal?6细胞，每3天换液传代。取约106个细胞抽提总RNA，操作按Trizol试剂说明进行。

　　1.3.2  RT?PCR 扩增mAFP基因

    上游引物：5′?AAGATCTCTGCGGTGAAGGAACAAG?3′；下游引物：5′?GGTTTAAACGCCCAAAGCATC?3′，并在两侧分别引入Bgl II和Pme I两个酶切位点,引物由赛百盛公司合成。扩增片段约1 850 bp。扩增条件：94℃ 4min，94℃ 30sec，56℃ 45sec 72℃ 2min，30个循环后72℃延伸10min，1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收目的片段。

　　1.3.3  mAFP基因序列测定

    将mAFP基因平端PCR产物加A并连接于pGM?T Easy T载体上，转化TOP 10感受态细菌，用X?gal和IPTG进行蓝白筛选，挑选白色阳性克隆摇菌，抽提质粒，用双酶切鉴定后送测序。

　　1.3.4  重组pAdBM5?GFP?mAFP腺病毒载体的构建

    分别对穿梭质粒pAdBM5?GFP和mAFP片段进行Bgl II和Pme I双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收；回收的载体片断和目的基因16℃连接过夜，直接取5μl 连接产物转化TOP10感受态细菌，用氨苄青霉素LB 培养基平板进行筛选，挑出4 个克隆,摇菌过夜，抽提质粒、双酶切鉴定正确的重组腺病毒载体命名为pAdBM5?GFP?mAFP。

　　1.3.5  重组腺病毒载体共转染HEK293A细胞

    将重组质粒用EcoR I酶切线性化，并取5μg与10μl QBI?Virus DNA混合，用标准的磷酸钙共沉淀法转染HEK293A细胞。通过基因同源重组，产生具有感染性的重组腺病毒颗粒。转染后6h，在单层细胞上覆盖3ml 1.25％SeaplaqueR琼脂糖混合物。在倒置荧光显微镜下观察病细胞病变效应（CPE）及绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况。

　　1.3.6  TCID50（Tissue cell infectious dosage50，TCID50）法测定重组腺病毒滴度

    将HEK293A细胞铺于2块96孔平底平板中，每孔100μl （104个细胞）。病毒稀释：在8个5ml一次性无菌离心管中，每管加入1.8ml DMEM2% (即含2％FBS的DMEM)，第一管加入0.2ml病毒储备液。取0.2ml 10?1的稀释液转入第二管。重复稀释直到需要的最高稀释倍数。用同样的病毒储存液进行第二系列的稀释。加样完毕后，将培养板置于37℃、CO2孵箱中培养10天，再读板分析。分排计数CPE个数。阴性对照为100μl HEK293A细胞。用K?RBER法病毒的滴度。

　　2  结果

　　2.1  RT?PCR扩增mAFP片段及序列测定

    将RT－PCR扩增的产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，显示在1 850bp处有扩增条带，片段大小与理论预期值一致，见图1。将回收的目的片段连接到pGM?T Easy载体，测序结果进一步证实克隆的序列完全正确。

　　2.2  重组pAdBM5?GFP?mAFP腺病毒载体的构建

    构建出的pAdBM5?GFP?mAFP重组质粒用Bgl II和Pme I双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳分别在大约8 000bp和1 850bp处可见一条带，表明mAFP基因已正确构建到穿梭载体中，见图2。

　　2.3  重组腺病毒制备

    线性化重组穿梭质粒与腺病毒DNA骨架混合共转染HEK293A细胞后，在倒置显微镜下观察，可见转染后的细胞明显增大、呈球形，细胞核变大，变圆，贴壁能力下降而易脱落（病细胞病变效应，CPE）。第7天出现明显病毒噬斑，肉眼为培养板底部白色小斑，见图3。感染后72h，在倒置荧光显微镜下观察，发生同源重组的病毒，可见报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的表达，见图4。

　　2.4  重组腺病毒扩增及病毒滴度测定

    转染10d后，收集产生感染性重组病毒颗粒细胞,在37℃/?80℃条件下反复冻融3次，离心沉淀后，取部分病毒上清再次感染HEK293A细胞以扩增重组病毒。如此反复进行多次可获得高滴度的重组腺病毒。TCID50法测定所得病毒滴度为3.2×108 PFU/ml。

　　3  讨论

    Massie报道 [5]，pAdBM5腺病毒表达系统，可使重组蛋白在293细胞中表达达到空前的水平。pAdBM5载体的主要特征是其增强子序列能显著增强重组腺病毒异位主要晚期启动子（Major late promoter，MLP）活性，感染293细胞不需要辅助病毒的参与。重组腺病毒在293细胞中同源重组比在细菌细胞中同源重组更为可靠，原理简单,转染效率较高,宿主范围广，可感染静止期和分裂期细胞,同时又不整合到宿主细胞基因组中，而且产生的病毒滴度高，体内外转染效率也高,因而越来越多地用于转基因，构建病毒疫苗等研究。本研究将小鼠AFP基因成功构建于pAdBM5腺病毒穿梭载体中并获得了高滴度具有感染性的重组腺病毒颗粒，为后续成功开展肝癌基因治疗奠定了基础。本研究采用的报告基因是绿色荧光蛋白（GFP），GFP是目前唯一在细胞内稳定表达、不需底物及辅助因子、无种属、组织及位置特异性的基因, 而且其产物对细胞也无毒性,结果可靠、检测简单 [6]。由于PFU测定法噬斑形成需要多个感染周期，需要3周左右才能得到结果。而且通常一个实验的结果很少能在其他的实验中得到重复，甚至在同一实验室的其他实验员也难以重复出同样的结果。因此本研究采用TCID50病毒滴度测定法，该方法的优点是快速（10d左右），操作更简单，结果易于计算，不同人员实验或不同批次实验之间重复性更好。

【】
  　　［1］Meng WS, Butterfield LH, Ribas A, et al. alpha?Fetoprotein?specific tumor immunity induced by plasmid prime?adenovirus boost genetic vaccination [J]. Cancer Res, 2001,61(24):8782?8786.

　　 [2] Shi YJ, Gong JP, Liu CA, et al. Construction of a targeting adenoviral vector carrying AFP promoter for expressing EGFP gene in AFP?producing hepatocarcinoma cell [J]. World J Gastroenterol, 2004,10(2):186?189.

　　 [3] Vollmer CM, Eilber JFC, Butterfield LH, et al. α?Fetoprotein?specific genetic immunotherapy for hepatocellular carcinoma［J］. Cancer Research, 1999,59（）:3064?3067.

　　 [4] Kanai F, Lan KH, Shiratori Y, et al. In vivo gene therapy for alpha?fetoprotein?producing hepatocellular carcinoma by adenovirus?mediated transfer of cytosine deaminase gene [J]. Cancer Res, 1997,57(3):461?465.

　　 [5] Massie B, Dionne J, Lamarche N，et al. Improved adenovirus vector provides herpes simplex virus ribonucleotide reductase R1 and R2 subunits very efficiently [J]. Biotechnology (N Y), 1995,13(6):602?608.

　　 [6] 杨朝辉,雷建军.绿色荧光蛋白基因研究进展［J］.生物学杂志,2000,17(5): 12?14.