硒化麒麟菜多糖抑制人喉癌细胞株Hep?2增殖的作用
作者：白雪，林晨，江振友，袁桂秀，沈伟哉，李扬秋，唐渝
【摘要】 目的 通过比较研究海藻麒麟菜多糖粗提物、无机硒化合物?亚硒酸钠（Na2SeO3）及其共价化合物?硒化麒麟菜多糖对人喉癌细胞株Hep?2的作用，探索新的具有抗肿瘤活性的有机硒化合物。方法 应用不同剂量的样品作用于Hep?2细胞株后，用MTT比色分析法肿瘤抑制率。结果 硒化多糖对Hep?2细胞的抑制率高于相同多糖浓度的麒麟菜多糖和相同硒浓度的亚硒酸钠（P<0.05）。硒化多糖的抑制率可高达71.53%，其多糖IC50与硒IC50分别为1805μg/ml和7.0μmol/L，分别低于麒麟菜多糖的多糖IC50(3034μg/ml)和亚硒酸钠的硒IC50(9.0μmol/L)。结论 硒化麒麟菜多糖具有抗Hep?2细胞增殖的活性，其抑制作用明显优于亚硒酸钠及天然麒麟菜多糖的抗肿瘤活性。
【关键词】 硒化麒麟菜多糖；亚硒酸钠；HEp?2；抗肿瘤
Abstract：Objective To investigate new antitumor selenium compound by studying the effect of Eucheuma Polysaccharide (EP), inorganic selenium compound??sodium selenite（Na2SeO3）and organoselenium compound－Eucheuma polysaccharide selenide (SeEP) on the proliferation of human larynx epidermoid carcinoma cell line Hep?2 in vitro. Methods HEp?2 cells were incubated with EP, Na2SeO3 and SeEP separately at different concentrations for 72 hours. The cell viability was measured by MTT colorimetric assay. Results The inhibitory ratios of SeEP are significantly higher than that of EP or Na2SeO3at some polysaccharide and selemium concentrations（P＜0.05),and reached to 71.53% at 4000μg/ml. The IC50s of SeEP are 1805μg/ml by polysaccharide and 7.0μmol/L by selenide, which are lower than 3034μg /ml of EP and 9.0μmol/L of Na2SeO3 respectively. Conclusion SeEP shows an antitumor effect on HEp?2 cells, and it is more potent than both EP and Na2SeO3.
Key words：Polysaccharide selenide；Sodium selenite；Hep?2； Antitumor
0 引言
近年来，随着对海洋生物活性研究的不断深入，对海藻多糖抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节作用进行了比较广泛和深入的研究。硒是人体必需的微量元素之一，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多方面的作用。近年来，含硒的生物大分子化合物的生物活性日益受到重视。有研究报道，灵芝硒化壳聚糖能够体外诱导K562细胞凋亡 [1]。本实验利用亚硒酸钠与麒麟菜多糖提取物化合而成的硒化麒麟菜多糖（以下简称硒化多糖）,有效地降低了硒的毒副作用，并增强了多糖的生物学功能，具有硒和多糖的双重功效。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株
人喉上皮细胞癌Hep?2细胞株。
1.1.2 麒麟菜多糖
暨南大学化学系提取，用PBS配制成8mg/ml的原液，用0.1mol/L的NaOH调pH值为7.2，高压蒸汽消毒，置4℃冰箱备用，使用前用RPMI1640液稀释。
1.1.3 硒化麒麟菜多糖
由暨南大学化学系合成并检测,含硒量为0.4μg/mg。用PBS配制成8mg/ml的原液，用0.1mol/L的NaOH调pH为7.2，高压蒸汽消毒，置4℃冰箱备用，使用前用RPMI1640液稀释。
1.1.4 亚硒酸钠
（Na2SeO3）国产分析纯,含量97%，相当于含硒量44.3%。用PBS配制成90μmol/L原液，置4℃冰箱备用，使用前用RPMI1640液稀释。
1.1.5 噻唑喃
（MTT, Sigma）用pH7.2的PBS配制成5.0g/L，过滤除菌，4℃避光保存，一周内使用。
1.1.6 二甲亚枫
（DMSO，国产分析纯）用pH7.2的PBS配制成30%体积分数备用。
1.1.7 仪器
450型酶标仪（BIO?RAD）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
Hep?2细胞株接种于含10%新生牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所,经56℃灭活30min）、青霉素、链霉素各100U/ml的RPMI1640（Gibco）培养液中,在37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，每3d按1∶3或1∶4（积比）体传代一次。
1.2.2 MTT比色分析法测定细胞抑制率
对数生长期细胞经胰蛋白酶（质量分数为0.25%）消化后,取100μl接种于96孔板内，细胞终浓度为1×105/ml，CO2培养箱中孵育1h；实验组将硒化多糖、亚硒酸钠和麒麟菜多糖倍比稀释成相应浓度梯度后，各孔中分别加入100μl，阴性对照组用等体积的培养液，每组设3个复孔。待细胞贴壁后，与受试物于CO2培养箱中共培养至72h，于培养结束前4h每孔加入MTT溶液（5g/L）20μl,继续培养4h后弃上清，每孔加入DMSO 200μl，振荡器上充分混匀10min待甲簪完全溶解后，在酶标仪上取检测波长570nm、参照波长655nm测定各孔光密度值（OD值）。根据MTT实验结果，计算细胞抑制率。
1.2.3 统计学方法
采用方差分析及t检验,应用SPSS10.0统计软件包进行统计学分析。
2 结果
2.1 对Hep?2细胞增殖的影响
硒化多糖各组对Hep?2细胞的抑制作用随多糖浓度（CONCp）增加逐渐加强，见表1。当浓度超过250μg /ml时，各组OD值均显著低于对照组（P＜0.05、P＜0.01），可见，硒化多糖从中浓度开始即表现出对Hep?2细胞增殖较明显的抑制作用,并随着浓度的升高，OD值不断降低，对Hep?2细胞增殖的抑制作用明显增强。计算硒化多糖回归方程为：lgy=0.06137?0.000134x，R=0.931，（P<0.01）。根据方程得硒化多糖的IC50为1805μg/ml。表1 硒化多糖与麒麟菜多糖对Hep?2细胞增殖的影响（略）
麒麟菜多糖中低浓度组（62.5～500μg /ml）对Hep?2细胞生长没有影响。而在高浓度组（1000～4000μg/ml）中，OD值降低较明显，显著低于对照组（P＜0.05、P＜0.01）。可见，麒麟菜多糖只有在高浓度下才表现出对Hep?2细胞增殖较明显的抑制作用，但其抑制作用（500μg/ml和1000μg/ml）仍明显弱于相应的硒化多糖组（P＜0.05、P＜0.01）。 计算麒麟菜多糖的回归方程为：
lgy=0.08566?0.0000877x，R=0.877，（P<0.01）。得IC50为3034μg/ml，亦大于硒化多糖的IC50。
以化合物中实际硒浓度(CONCse)为依据比较硒化多糖和亚硒酸钠两组对Hep?2细胞生长的影响，见表2。可见，硒化多糖开始出现抑制作用时，其硒浓度为1.3μmol/L。随硒浓度增高，其抑制作用逐渐增强。而亚硒酸钠的硒浓度达到2.5μmol/L时，才表现出对Hep?2细胞增殖的抑制趋势，随着浓度的增加，OD值逐渐降低，抑制趋势逐渐明显。当浓度≥5.0μmol/L时，各组OD值均显著低于对照组（P＜0.05、P＜0.01），表现出明显的抑制作用，但其作用（0.6μmol/L、1.3μmol/L和2.5μmol/L）仍低于相应的硒化多糖组（P<0.01）。亚硒酸钠的回归方程为：lgy=0.175?0.0508x，R=0.992，（P<0.01）。比较硒化多糖与亚硒酸钠的IC50，前者也小于后者（7.0μmol/L、9.0μmol/L）。表
2 硒化多糖与亚硒酸钠对HEp?2细胞增殖的影响（略）
2.2 对Hep?2细胞增殖抑制率的比较
分别以培养体系中所含多糖浓度和硒浓度为标准，比较硒化多糖与麒麟菜多糖、亚硒酸钠对Hep?2细胞增殖的抑制率，见图1。结果显示，硒化多糖与麒麟菜多糖对Hep?2细胞增殖的抑制作用均随多糖浓度的升高而增强，硒化多糖组抑制率明显好于麒麟菜多糖组，且在500μg/ml（P＜0.01）和1000μg/ml（P＜0.05）两组有明显差别。本实验中，麒麟菜多糖的最高抑制率不超过55.36%，硒化多糖的最高抑制率达到71.53%，见图1?A。
亚硒酸钠对Hep?2细胞增殖的作用随硒浓度变化有所不同,低硒浓度（≤0.6μmol/L）的亚硒酸钠对Hep?2细胞增殖表现为促进趋势。当硒浓度达到1.3μmol/L时,亚硒酸钠对细胞生长的抑制作用才显现出来,且与硒浓度成正相关。当硒浓度在5μmol/L以内时，硒化多糖抑制率明显大于亚硒酸钠组（P＜0.01）。当硒浓度达到10μmol/L时，亚硒酸钠的抑制率超过硒化多糖（P＜0.05），并表现出明显的细胞毒作用，见图1?B。
3 讨论
多糖是普遍存在于动植物和微生物中的一类天然大分子聚合物。大量研究表明，多糖可能为通过调节免疫功能 [2]、改变细胞膜的组分 [3]、影响信号传导通路 [4]、影响抑癌基因 [5]等机制对多种肿瘤细胞发挥一定的抑制作用。
硒是人体必需微量元素之一。近些年来，硒与肿瘤的关系受到更广泛的关注 [6]。无机硒抗肿瘤的主要机制可能有：（1）作为谷胱甘肽过氧化物酶（GSH?Px）的活性成分, 具有抗氧化损伤的功能 [7]；（2）通过调控转录因子影响癌基因的表达；（3）通过抑制MAPK/ERK1/2等相关蛋白的表达 [8]，阻断癌细胞分裂增殖的信息传递；（4）免疫调节作用。然而，硒元素的生理剂量范围很小，且具有蓄积性毒性和致突变作用，超过一定剂量则转化为药理作用甚至毒理作用，极大地限制了无机硒在抗肿瘤方面的实际应用。
与无机硒相比，有机硒的毒性低,副作用小, 生物利用率高，不易蓄积，能够更好地发挥硒的生物学功能。本实验将有机硒化麒麟菜多糖与麒麟菜粗多糖、亚硒酸钠对人喉癌细胞系Hep?2生长的抑制作用做了比较。结果表明，麒麟菜多糖在高浓度（1000～4000μg/ml）下具有对人喉癌细胞株Hep?2的抑制作用，这与杨宜婷 [9]的研究相吻合。而无机硒对肿瘤细胞有促进分化，抑制分裂的双向调节作用，与报道相吻合 [8]。硒化多糖对Hep?2细胞的抑制率高于相应浓度的麒麟菜多糖组或亚硒酸钠组（P＜0.05）；最大抑制率（71.53%），高于麒麟菜多糖（55.36%）。从作用效能来看，硒化多糖的多糖IC50（1805μg/ml）与硒IC50（7.0μmol/L）分别低于麒麟菜多糖（3034μg/ml）和亚硒酸钠（9.0μmol/L）。
可见，硒化多糖对Hep?2细胞的抑制作用不仅强于麒麟菜多糖和亚硒酸钠，而且当肿瘤抑制率达到50%时，硒化多糖的这一硒浓度和多糖浓度均低于单独使用无机硒或麒麟菜多糖所需要的浓度。硒化多糖的这种抗肿瘤活性可能与其结构改变有关，从而引起了多糖和硒的生物功能互补。其协同作用可能表现为以下几个方面：首先，硒化多糖的结构更有利于硒成为GSH?Px的活性中心，发挥抗氧化损伤的功能,消除体内有害的氧自由基，起到对致癌物引起的染色体断裂不同程度的抑制作用。其次，多糖还能减少丙二醛（MDA）的生成，增加GSH?Px及超氧化物歧化酶（SOD）的活性，减少组织中脂褐质（LPO）含量, 清除氧自由基及抗脂质过氧化 [9]，与无机硒起到协同作用。第三，多糖协同硒可能更有效地调控NF?κB、AP?1、p53、MAZ等转录因子，从而影响癌基因的表达。最后，通过协同抑制相关蛋白的表达，影响MAPK等信号级联反应通路，从而进一步阻滞细胞周期，影响细胞的生长、发育、分化及细胞增殖等，最终导致肿瘤细胞凋亡 [10]。硒化多糖的结构与其抑制肿瘤活性的关系值得我们进一步深入研究。
综上，对Hep?2细胞的抗癌实验证明了硒化麒麟菜多糖减少了硒的作用剂量，降低了无机硒的毒性，并提高了多糖的抑癌作用，在一定程度上克服了亚硒酸钠与天然麒麟菜多糖的缺点，发挥了二者各自的优势。表明硒化麒麟菜多糖在肿瘤中可能具有较强的应用价值，并可推广到其他恶性肿瘤的研究中，有望成为新的抗癌药物。
【文献】
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