口腔鳞状细胞癌基质金属蛋白酶9表达及其与血管生成的关系
【摘要】 ［目的］探讨口腔鳞状细胞癌（OSCC）发生、过程中基质金属蛋白酶9（MMP9）对微血管生成的意义。［方法］采用免疫组化SP法对65例OSCC、40例非典型增生、22例正常口腔黏膜进行MMP9、CD34免疫组化染色。检测OSCC、非典型增生、正常口腔黏膜中MMP9的表达和微血管密度（MVD），并分析MMP9的表达与MVD之间，以及它们与OSCC临床病理特征之间的关系。［结果］OSCC组中MMP9的表达与MVD值均高于非典型增生组，在非典型增生组中均高于正常口腔黏膜组；OSCC组、非典型增生组和正常口腔黏膜组中MMP9表达与MVD有正相关趋势；MMP9的表达与肿瘤大小、淋巴结转移密切相关，MVD与淋巴结转移密切相关。［结论］MMP9可能是OSCC的重要促血管生成因子之一。
【关键词】 口腔鳞状细胞癌 免疫组织化学 基质金属蛋白酶9 CD34
Correlation between Expression of Matrix Metalloproteinase9 and Angiogenesis in Oral Squamous Cell Carcinoma
Abstract: ［Purpose］ To study the significance of matrix metalloproteinases9 (MMP9) on micro angiogenesisin carcinogenesis and progression of oral squamous cell carcinoma (OSCC). ［Methods］MMP9 and CD34 were detected by immunohistochemistry SP method in 22 cases of normal oral mucosa, 40 cases of atypical hyperlasia and 65 cases with OSCC. The expression of MMP9 and microvessel density (MVD) were detected in the three groups and the relationship between expression of MMP9 and MVD and its relationship with OSCC clinicpathological characteristics were reviewed.［Results］ The expression of MMP9 and the level of MVD in OSCC were significantly higher than that in atypical hyperlasia. The expression of MMP9 and the level of MVD in the group of atypical hyperlasia were significantly higher than that in normal oral mucosa. The expression of MMP9 were closely related with MVD in the tumor group, atypical hyperlasia group and normal oral mucosa group. MMP9 expression in OSCC was significantly associated with lymph node metastasis and tumor size. MVD in OSCC was significantly associated with lymph node metastasis. ［Conclusion］ MMP9 may be one of important factors in angiogenesis ofOSCC.
Key words: oral squamous cell carcinoma; immunohistochemistry; matrix metalloproteinases9; CD34
肿瘤内新生血管的生成是影响肿瘤增殖和转移的重要因素，近年来的研究表明[1]基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）在肿瘤血管生成中有重要作用，明胶酶是MMPs的一个亚类，包括基质金属蛋白酶2（MMP2）和基质金属蛋白酶9（MMP9），其中MMP9与肿瘤血管生成的关系研究较少，研究结果也不一致，有关口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）组织中MMP9与肿瘤血管生成的关系，更少见报道。本研究通过免疫组织化学技术检测口腔鳞状细胞癌组织中MMP9和CD34的表达，并对MMP9的表达与微血管密度（MVD）做定量分析，探讨口腔鳞状细胞癌组织中MMP9对血管生成的作用及其临床意义。
1 材料与方法
1.1 资料来源
本研究所用石蜡包埋组织标本选自安徽医科大学第一附属1998年1月至2001年12月的手术患者。口腔鳞状细胞癌患者65例，均为作口腔鳞状细胞癌根治性手术的患者，术前未作放疗或化疗，术后经病理诊断确诊为口腔鳞状细胞癌，男性35例，女性30例，中位年龄45.5岁；肿瘤最大直径≤3cm者35例，>3cm者30例；有淋巴结转移者31例，无淋巴结转移者34例；临床分期为Ⅰ期15例，Ⅱ期28例，Ⅲ期15例，Ⅳ期7例；其中高分化鳞癌18例，中分化鳞癌24例，低分化鳞癌23例。口腔非典型增生病例40例，来自其他口腔疾患手术标本，正常口腔黏膜22例，取自活检标本，均未做过任何。
1.2 方 法
鼠抗人MMP9多克隆抗体和CD34单克隆抗体，免疫组化SP试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。 所有组织均经10%甲醛液固定，常规石蜡包埋， 包埋组织标本作4μm连续切片，免疫组化SP法染色参照试剂说明书进行， MMP9、CD34均采用高温直接煮沸法修复抗原。用已知的阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 结果判定
⑴MMP9以实质细胞胞膜或胞质出现明显的黄色或棕黄色颗粒判断为阳性着色。定量及图像分析采用同济医大千屏影像公司HPLAS1000病理图像分析系统,将切片上的阳性染色信号转为灰度进行分析。
⑵MVD计数，参照Weinder[2]报道的方法进行微血管计数，先在低倍镜（×100）下观察确定血管密度最高处，在（×200）视野下选择3个高血管密度区，单位视野（×200）平均血管数。单个内皮细胞或内皮细胞簇，均作为一个血管计数，而直径大于约8个红细胞的血管，有厚肌壁的血管以及硬化区的血管不在计数范围内。
1.4 统计学处理
运用SPSS 10.0统计软件包进行统计分析，采用t检验和F检验。
2 结 果
2.1 MMP9在正常口腔黏膜组织、非典型增生、OSCC中的表达和分布
MMP9阳性细胞胞浆或胞膜呈棕黄色，偶尔可见细胞核着色，阳性颗粒多呈团块状。MMP9在癌组织中于肿瘤细胞(见图1)、增生上皮细胞和间质细胞均有阳性表达，在血管平滑肌细胞，血管内皮细胞上也有明显阳性表达(见图2)，MMP9阳性分布呈异质性，阳性细胞多位于癌巢边缘和管腔周围，其中基底膜附近的肿瘤细胞染色尤为明显。MMP9在非典型增生的表达主要位于增生上皮细胞的胞质中，在间质细胞中偶见染色。MMP9在正常口腔黏膜组织表达微弱，仅见于少数上皮细胞的胞质中。对切片的MMP9染色进行灰度分析，结果显示从正常口腔黏膜，非典型增生到OSCC， MMP9的表达逐渐增高，OSCC组中MMP9表达显著高于非典型增生组织（P<0.05），非典型增生组中MMP9表达显著高于正常口腔黏膜（P<0.05），见表1。 MMP9在瘤径>3cm组中的表达显著高于瘤径≤3cm组（P<0.05），在淋巴结转移组中的表达显著高于无淋巴结转移组（P<0.05），而与肿瘤的分化程度、临床分期无关（见表2）。
2.2 正常口腔黏膜组织、非典型增生、OSCC中MVD的分布
CD34标记的微血管呈点状分布，血管内皮细胞膜被染成褐色。肿瘤组织中的微血管形态不规则，部分血管呈现发芽状，血管分布不均匀，在肿瘤的边缘区域最为密集，呈簇状(见图3)。非典型增生组织中微血管形态较规则，但分布不均，血管簇偶见。正常口腔黏膜组织内的微血管形态规则，分布均匀。OSCC组中MVD显著高于非典型增生组织（P<0.05），非典型增生组中MVD显著高于正常口腔黏膜（P<0.05），见表1。OSCC中MVD在淋巴结转移组中的表达显著高于无淋巴结转移组（P<0.05）， MVD与肿瘤的大小、分化程度、临床分期无关（见表2）。
2.3 OSCC中MMP9表达与OSCC血管生成的关系
OSCC中MMP9表达与MVD显著高于非典型增生组（P<0.05），非典型增生组MMP9表达与MVD显著高于正常口腔黏膜（P<0.05），OSCC组、非典型增生组和正常口腔黏膜组中MMP9表达与MVD呈正相关趋势（见表2）。
3 讨 论
肿瘤的侵袭和转移是多步骤过程。实验表明[3]肿瘤组织中微血管密度越大，肿瘤细胞进入血循环及淋巴循环的机会越多，淋巴结及邻近脏器转移的机会也增大。MMP9由结缔组织细胞、巨噬细胞或肿瘤细胞分泌，是降解Ⅳ型胶原最主要的酶，在生理情况下维持细胞外基质，在胚胎发育、组织塑形中起着不可替代的作用。在病理情况下，MMP9通过降解细胞外基质成分中的Ⅳ型胶原使得肿瘤细胞突破原发部位正常的基底膜而发生浸润，突破脉管周围的基底膜进入脉管系统，即发生转移。近来研究表明[1，4]，MMP9不仅是降解基底膜和ECM的关键酶，而且在肿瘤间质血管生成中起重要作用。
本研究结果显示从正常口腔黏膜，非典型增生到OSCC，MMP9的表达逐渐增高，在非典型增生MMP9的表达主要位于增生上皮细胞的胞质中，在癌组织中MMP9在肿瘤细胞，增生上皮细胞和间质细胞均有阳性表达，在表达的强度、阳性细胞的种类、数量上均高于非典型增生组，提示MMP9可能在OSCC发生中发挥作用。同时观察到并非所有肿瘤细胞均能表达MMP9，具有MMP9表达能力的肿瘤细胞多位于这部分细胞多位于肿瘤的外周部分和毛细血管淋巴管腔周围，呈片状、灶状分布，提示表达MMP9的细胞具有更强的侵袭能力，符合肿瘤细胞的侵袭。在本实验中还观察到，在毛细血管腔和淋巴管腔周围及管腔内部可见聚集成团状并深度着色的癌细胞，可能为迁移到该处的高转移性癌细胞克隆增殖而成。另外表达MMP9的肿瘤细胞附近的血管平滑肌细胞、血管内皮细胞上也有明显阳性表达，提示该区域的血管平滑肌细胞，血管内皮细胞与肿瘤细胞在MMP9的表达上存在着联系，分析结果显示MMP9在瘤径>3cm组中的表达高于瘤径≤3cm组，在有淋巴结转移组中的表达高于无淋巴结转移组，提示MMP9可能是OSCC侵袭和转移的重要促进因素。
本实验中显示从正常组织→非典型增生→OSCC，组织中的MVD有逐渐增加趋势，非典型增生组中的MVD显著高于正常组，提示细胞在未发生恶性转化之前已有血管生成增多，这一现象是否为OSCC血管生成的启动阶段有待于作进一步研究。Eisma等[5]对头颈部鳞癌研究发现MVD每增加10个，淋巴结转移的危险度就增加1.32倍，在本研究中显示OSCC淋巴结转移组中MVD显著高于无淋巴结转移组，由于在OSCC中发生淋巴结转移的机会远高于血行转移，提示对OSCC原发灶MVD检测有利于作出转移和预后优劣的判断，但是否能作为OSCC的一个独立预后因素尚需要做进一步研究。
大量研究显示MMPs与肿瘤血管生成关系密切，在本实验中我们观察发现MMP9的表达部位与MVD高密度区具有一致性，均位于肿瘤细胞生长活跃的癌巢边缘地区，提示：①肿瘤在局外浸润生长的过程中，新生血管化是同步进行的；②MMP9的表达与肿瘤血管形成有关。在本实验中我们还观察到MMP9不仅在肿瘤细胞和间质细胞中表达，在肿瘤组织的血管内皮细胞上MMP9也有表达，这与MMP9参与肿瘤新生血管形成的观点一致。有研究显示[6]肿瘤的新生血管内皮细胞可以通过分泌MMP9降解周围基质，调节内皮细胞的迁移，使自身的血管条索延长和扩大，也有研究显示[7,8]血管生成因子VEGF在促进肿瘤内新生血管形成的同时，可以通过不同的信号途径，促进MMP9的表达并对TIMP1的表达进行抑制。 这些研究说明MMP9通过多种途径对肿瘤新生血管形成起作用，总体上表现出促进作用。本研究结果表明 OSCC中MMP9的表达显著高于非典型增生，其MVD也显著高于非典型增生 ，MMP9的表达与MVD具有一致性，MMP9与肿瘤新生血管形成关系密切。
本研究结果表明MMP9、新生血管形成与OSCC发生和侵袭转移有密切关系，MMP9可能是OSCC的重要促血管生成因子之一。阻断MMP9的表达，抑制MMP9的活化可能具有抑制OSCC转移和血管生成的双重意义。
【】
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