酪丝亮肽对人肝癌BEL7402细胞的抑制作用及对NK细胞杀伤活性的影响

【摘要】  　　［目的］研究三肽化合物酪丝亮肽（tyroserleutide，YSL）对人肝癌BEL7402裸鼠移植瘤的抑制作用及对杀伤细胞（NK细胞）杀伤活性的影响。［方法］建立人肝癌BEL7402裸鼠移植瘤模型，观察YSL对肿瘤生长的抑制作用；采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测YSL对正常小鼠及人肝癌BEL7402荷瘤鼠的NK细胞杀伤活性的影响。［结果］ YSL[160μg/（kg·d）]能抑制BEL7402的生长，肿瘤抑制率为72.23%，且能增强BEL7402荷瘤裸鼠及正常小鼠NK细胞杀伤活性，与生理盐水组相比均具有显著性差异（P <0.05）。［结论］ YSL对人肝癌BEL7402裸鼠移植瘤有抑制作用，并具有增强正常及荷瘤小鼠NK细胞杀伤肿瘤细胞活性的作用。

【关键词】  酪氨酸　丝氨酸　亮氨酸　小鼠　裸　肿瘤　实验性　肝肿瘤　杀伤细胞　天然

　　 Inhibitive Effect of Tripeptide Tyroserleutid（YSL） on Human Hepatocellular Carcinoma BEL7402 cells and Its Effect on the Activity of NK Cell

        Abstract:［Purpose］To investigate the inhibitive effect of tripeptide tyroserleutide（YSL） on human hepatocellular carcinoma BEL7402 transplanted tumor in nude mice and its effect on the activity of natural killer cells (NK cell). ［Methods］ Human hepatocellular carcinoma BEL7402 transplanted tumor model in nude mice was created.The inhibition of YSL on tumor growth was studied.The effect of YSL on the activity of NK cell in normal mice and in nude mice transplanted with hepatocellular carcinoma BEL7402 were detected by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) colorimetric assay. ［Results］YSL [160μg/(kg·d)] could inhibit the growth of transplanted hepatocellular tumor BEL7402 in nude mice,with tumor inhibition rate 72.23%,and could enhance the activity of NK cell in natural mice and in nude mice transplanted with hepatocellular carcinoma BEL7402,which all had significant difference compared with the control group (P <0.05).［Conclusions］YSL has inhibition effect in hepatocellular carcinoma BEL7402 transplanted tumor,and can enhance the activity of NK cell.

    Key words: tyrosine; serine; leucine; mice,nude; neoplasms,experimental; liver neoplasms; killer cells,natural酪丝亮肽是我国自主研发的小分子多肽化合物，由三个氨基酸组成，化学结构组成为L酪氨酰L丝氨酰L亮氨酸，分子结构式为C18H27N3O6，分子量为381.42，国家药典委员会批准通用名称为酪丝亮肽（Tyroserleutide，YSL）。YSL在前期研究结果显示出较强的抗实验性肝癌作用[1,2]，2003年9月中国国家药品与食品管理局（SFDA）批准，进入Ⅰ期及Ⅱ期临床实验研究，已取得初步疗效。本课题对此化合物的抗肿瘤作用及相应机制进行初步探讨。

    1 材料与方法

    1.1 药品及主要试剂

    YSL由深圳康哲药业有限公司提供，RPMI Medium1640培养液购自GIBCO试剂公司， 胎牛血清购自Hyclone 试剂公司，MTT购自SIGMA试剂公司。

    1.2 细胞株

    YAC1细胞株，天津医科大学免疫教研室保存。

    1.3 实验动物

    健康BALB/c小鼠（CLA即清洁动物级），雄性，6~8周龄，体重18g~22g，购自军事医学院实验动物中心。

    健康BALB/c(nu/nu)裸鼠（SPF即无特定病原体动物级），雄性，4~5周龄，体重18g~22g，与荷人肝癌BEL7402裸鼠均购自中国医学科学院肿瘤研究所动物中心。于独立换气的无特定病原体的层流柜中饲养，所用饲料、垫料、饮用水均为无菌处理，严格按照NIH标准（安全操作号：A38731）进行。

    1.4 YSL对正常小鼠NK细胞杀伤活性的影响[3]

    将30只健康BALB/c小鼠随机分为YSL不同剂量组[160μg/(kg·d)、80μg/(kg·d)]、生理盐水组，每组10只，连续腹腔注射给药，每日1次，连续给药28d。于给药结束后次日处死小鼠，无菌条件下取脾脏，常规制备脾细胞悬液，以PRMI1640液调整细胞浓度为4×106个/ml，将已达到对数生长期的YAC1细胞制成1×105/ml[4]，于96孔细胞培养板中加入各组小鼠脾细胞悬液100μl/孔和细胞培养基100μl/孔，作为效应细胞孔，设3个复孔；加YAC1细胞100μl/孔和培养基100μl/孔，作为靶细胞孔，设2个复孔；加YAC1细胞100μl/孔和各组小鼠脾细胞悬液100μl/孔，作为实验孔，设3个复孔。将加好样品的96孔培养板，置于37℃、5%二氧化碳孵箱中培养4h后用MTT法检测NK细胞杀伤活性。按以下公式NK细胞杀伤率：NK细胞杀伤率(%)=[1-(实验细胞孔OD值-效应细胞孔OD值)/靶细胞孔OD值]×100%。

    1.5 YSL对人肝癌BEL7402裸鼠移植瘤的影响[5]

    选取肿瘤直径大于1cm，生长状态良好的荷人肝癌BEL7402裸鼠，无菌条件下将新鲜的瘤组织切成2～4mm3的小块，置于RPMI1640培养液中，在裸鼠腹部外侧皮下剪一小口，用无钩眼科镊子将瘤块移植于皮下。将已接种肿瘤的裸鼠，随机分为生理盐水组(每日0.2ml/只)、YSL不同剂量组[160μg/(kg·d)、80μg/(kg·d)]，每组10只。各组药物分别溶于0.2ml生理盐水中，于肿瘤接种后次日，经腹腔注射，每日1次，连续给药60d。于给药结束后次日，逐只剖取肿瘤，称量、记录瘤重，并检查肿瘤有无坏死感染等情况。用游标卡尺测量肿瘤的3个互相垂直的直径，代入下式计算：V=(1/6)πABC。V为肿瘤体积，A、B、C为瘤体的3个直径。计算肿瘤抑制率（％）=(对照组平均瘤重－实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。

    1.6 YSL对BEL7402荷瘤裸鼠NK细胞杀伤活性的影响[4]

    无菌条件下取1.5中各组小鼠脾脏，用MTT法检测YSL对BEL7402荷瘤裸鼠NK细胞杀伤活性的影响，实验步骤同1.4。

    1.7 统计学方法

    使用SPSS统计软件，各组资料采用方差分析，两两比较采用leastsignificant difference（LSD）检验，以Ｐ <0.05为有显著性差异。

    2 结 果

    2.1 YSL对正常小鼠NK细胞杀伤活性的影响

    YSL剂量为160μg/(kg·d)及80μg/(kg·d)时能够增强正常小鼠NK细胞杀伤活性，剂量为160μg/(kg·d)时与生理盐水组比较具有显著性差异（P <0.05），结果见表1。

    2.2 YSL对人肝癌BEL7402裸鼠移植瘤的影响

    YSL剂量为160μg/(kg·d)时能够抑制人肝癌BEL7402裸鼠移植瘤的生长，与生理盐水比较具有显著性差异(P <0.05)，肿瘤抑制率为72.23%。YSL剂量为80μg/(kg·d)时对BEL7402有一定的抑制作用，抑制率为53.69%，但与生理盐水组比较无显著性差异(P >0.05)，结果见表2。

    2.3 YSL对BEL7402荷瘤裸鼠NK细胞杀伤活性的影响

    YSL剂量为160μg/(kg·d)时能够增强人肝癌BEL7402荷瘤裸鼠NK细胞的杀伤活性，与生理盐水组比较有显著性差异（P <0.05），结果见表3。

    3 讨 论

    原发性肝胆癌症的发病及致死率很高[5]。大约90%成人原发性肝癌为肝细胞癌[6]，故本课题采用BEL7402人肝细胞肝癌细胞株制备裸鼠移植瘤模型展开研究，结果显示YSL可以显著抑制人肝癌BEL7402裸鼠移植瘤的生长，给药剂量为160μg/(kg·d)与80μg/(kg·d)时，抑瘤率分别为72.23%、53.69%。目前多肽类药物的抗肿瘤作用，正在引起专家学者们的广泛重视[7]，如4个氨基酸的小肽Tuftsin在体情况下可以抑制肝癌、胃癌、黑色素瘤和裸鼠胆管癌的生长[8] ；从肝素结合细胞因子（HGP）中β链区域合成的五肽或六肽，表现出抗肿瘤细胞增殖的作用，在播散早期应用还能抑制肝转移的发生 [9]。YSL是一种新型短肽类抗肿瘤药物，其抗肿瘤作用机制尚不十分清楚。

    肿瘤的发生和与机体免疫功能具有十分密切的关系。免疫力低下的人群肿瘤发生率高，恶性肿瘤发生后又能产生免疫抑制因子抑制宿主的免疫功能[10,11]。小分子肽类药物可以作用于机体的免疫系统，充分调动机体自身免疫系统的主动性，发挥抗肿瘤作用[12,13]。机体的抗肿瘤免疫学机制十分复杂，其中由T淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞介导的细胞免疫，在抗肿瘤免疫中起主要作用[14]。NK细胞杀伤肿瘤细胞不受MHC限制，也不需预先与抗原接触或显示任何记忆反应。NK细胞对肿瘤的杀伤优势表现为直接溶解和分泌细胞因子两个方面，其杀伤肿瘤既可通过穿孔素又可通过Fas 配基。NK细胞可以产生TNFα、IFNγ和IL1，这些细胞因子在NK细胞抗癌反应中有十分重要地位[15]。本研究证实，YSL可以增强正常小鼠NK细胞对肿瘤细胞的非特异性杀伤活性，抑制人肝癌BEL7402裸鼠移植瘤的生长，同时增强人肝癌BEL7402荷瘤裸鼠NK细胞的杀伤活性。裸鼠是一种先天无胸腺或仅有胸腺残迹或异常上皮的免疫缺陷动物。T细胞不能正常分化，缺乏成熟T细胞的辅助、抑制系杀伤功能，细胞免疫力低下，其体内非依赖T细胞免疫机制如NK及巨噬细胞具有较高活性 [16]。因此，YSL可能是通过增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力来抑制肿瘤的增殖。

【】
  [1] 傅正, 陆融, 李国立, 等. 酪丝亮肽对人肝癌BEL7402细胞钙稳态影响的实验研究[J]. C辑:生命科学, 2005,35(3)262-268.

[2]邱爽, 陆融, 赵岚, 等. 三肽化合物酪丝亮肽抗肿瘤作用及对单核巨噬细胞激活作用机制的研究[J].中国肿瘤生物杂志, 2005,12(2): 129-133.

[3] 徐叔云, 卞如濂, 陈修. 药理实验方法学[M].第3版. 北京：人民卫生出版社, 2002. 1785-1786.

[4] 章元沛, 苏怀德. 药实验[M].第2版. 北京：人民卫生出版社, 1998, 137-138.

[5] 韩锐. 抗癌药物研究与实验技术[M]. 北京:北京医科大 学中国协和医科大学联合出版社, 1997.299-300.

[6]American Cancer Society. Cancer facts ＆ figures 2004. The American Cancer Sociey，s publication [M]. USA: American Cancer Society Inc. 2004.

[7] Janin YL. Peptides with anticancer use or potential[J]. Amino Acids, 2003,25:1-40.

[8] 雷新, 韩本立. Tuftsin 的合成及对裸鼠胆管癌模型的作用[J]. 第三军医大学学报, 2002, 22:75-77.

[9] Fazekas K,Raso E, Zarandi M, et al. Basic HGFlike peptides inhibit generation of liver metastases in murine and huma tumor models[J]. Anticancer Res, 2002, 22:2575-2579.

[10] Ma D, Gu MJ. Immune effect of tumor infiltrating lym phocytes and its relation to the survival of patients wothovarian malignancies[J]. Tongji Med Univ, 1991, 11(4):235-239.

[11] Maehara Y, Tomisaki S, Oda S, et al. Lymph node metastasis and relation to tumor growth potential and local immune response in advanced gastric cancer[J]. Int J Cancer, 1997, 74(2):224-228.

[12] Koji Teramoto, Keiichi Kontani, Yoshitomo Ozaki, et al. Deoxyribonucleic Acid(DNA) encoding a panmajor histocompatibility complex class Ⅱ peptide analogue augmented antigenspecific cellular immunity and suppressive effects on tumor growth elicited by DNA vaccine immunotherapy[J]. Cancer Res, 2003, 63:7920-7925.

[13] Matsuzaki A, Sumioe A, Hattori H, et al. Immunotherapy with autologous dendritic cells and tumorspecific synthetic peptides for synovial sarcoma[J]. J Pediatr Hematol Oncol, 2002, 24(3):220-223.

[14] Koh CY, Ortaldo JR, Blazar BR, et al. NKcell purging of leukemia:superior antitumor effects of NK cells H2 allogeneic to the tumor and augmentation with inhibitory receptor blockade[J]. Blood, 2003, 4067-4068.

[15] 蒋灿华, 陈万涛, 张志愿. NK细胞抗肿瘤免疫效应机制研究进展[J]. 国外医学肿瘤分册, 2004, 31:486-487.

[16] 魏泓. 医学实验动物学[M]. 成都：四川科学技术出版社, 1998. 412.