结肠癌组织中抗凋亡基因bag?1和bcl?2的表达及意义
【摘要】 目的 研究抗凋亡基因bag?1和bcl?2在结肠癌组织中的表达及意义，并探讨二者之间的关系。方法 应用免疫组织化学SABC法对64例结肠癌组织及10例正常结肠组织中bag?1和bcl?2基因的表达进行检测。结果 结肠癌组织中bag?1和bcl?2蛋白阳性表达率分别为64.1%和70.3%，显著高于结肠正常组织10.0%（P<0.05）；bag?1和bcl?2在结肠癌中的表达与结肠癌病理类型无关，但bag?1与病理分级密切相关（P<0.05），而bcl?2与病理分级无明显相关性（P>0.05）；抗凋亡基因bag?1和bcl?2在结肠癌的发生过程中呈正相关，r＝0.475。结论 结肠癌组织中有不同水平的bag?1和bcl?2蛋白的高表达，两者相互作用并通过调节细胞凋亡而参与结肠癌的发生、发展，它们可以作为结肠癌早期筛选的一项指标，并对疾病的预后有着重要意义。
【关键词】 结肠癌 bag?1 bcl?2 细胞凋亡
0 引言
结肠癌是人类胃肠道最常见的恶性肿瘤之一，且其发病率有逐年上升的趋势。细胞凋亡障碍是肿瘤发生的重要机制之一，目前的研究表明，凋亡是一个多受基因控制的过程［1］。bag?1是最近才发现的一种多功能结合蛋白，它具有与抗凋亡基因bcl?2相互结合，相互影响，从而促进细胞抗凋亡的能力［1?4］，抗凋亡基因bag?1在肿瘤发生发展中的作用正成为国内外研究的热点问题之一，但目前国内关于它在胃肠道肿瘤发病中作用的研究尚未见有关报道。在本研究中我们采用免疫组织化学研究了64例结肠癌中bag?1和bcl?2的表达情况，并就其临床意义及相互关系作了初步探讨。
1 材料和方法
1.1 材料 收集2001～2003年手术切除的结肠癌石蜡包埋组织块64例，均来自协和病理科存档标本，标本均经过4%多聚甲醛灌注固定，常规石蜡包埋连续切片，厚约5μm。病人年龄范围为35～67岁。按WHO病理分级，腺癌46例，粘液癌10例，未分化癌8例。其中高分化腺癌18例，中分化18例，低分化10例。同时选择10例正常结肠组织石蜡标本作对照。
1.2 方法 兔抗人多克隆bag?1抗体为美国Santa Cruz公司产品。兔抗人bcl?2抗体和SABC免疫试剂盒购自北京中山生物制品公司。采用SABC法测定bag?1和bcl?2的表达，抗bag?1的工作浓度1∶50，生物素化单抗和SABC试剂的工作浓度均为1∶100。石蜡组织连续切片5μm，载玻片防脱片处理，常规脱蜡至水。石蜡切片经热抗原修复，滴加正常山羊血清封闭过夜，室温20min，甩去多余液体，滴加1∶50抗bag?1或bcl?2抗体，4℃敷育过夜，次日滴加生物素化山羊抗兔IgG，20℃～37℃20min，再滴加SABC试剂，20℃～37℃20min，PBS 5min×4次，DAB室温显色20 min，苏木素复染，脱水，透明，封片。以PBS代替一抗作阴性对照，以已知阳性反应片作阳性对照。
1.3 判定标准 bag?1和bcl?2皆以胞质、胞核棕黄色为阳性。在10×40倍光镜下随机观察5个视野，其平均数，每个视野计数100个细胞。bag?1阳性细胞占肿瘤细胞数<10%为低表达（+），10%～30%为中度表达（++），>30%为高表达（+++）。bcl?2阳性细胞占肿瘤细胞数<30为低表达（+），30%～50%为中度表达（++），>50%为高表达（+++）。
1.4 统计学方法 阳性表达率比较用χ2检验，bag?1与bcl?2的关系采用相关系数（r）分析。
2 结果
2.1 bag?1和bcl?2在结肠癌组织中的表达
2.1.1 bag?1的表达 bag?1在结肠癌组织的免疫组化染色分为不表达、胞质表达、胞核表达和在二者同时表达四种形式。大部分表达在胞核，小部分表达在胞质，呈棕黄色颗粒，染色强弱不等。bag?1在10例正常组织中只有1例阳性表达，阳性率为10%，在结肠癌组织中的阳性表达有41例，阳性率为61.4%，二者有显著性差异（P<0.05），见图1、图2、图5。
2.1.2 bcl?2的表达 bcl?2蛋白的表达部位主要在细胞核或胞质，成灶状或弥漫状分布。在10例结肠正常组织中，bcl?2蛋白阳性表达1例，阳性率为10%，主要在胞核成灶性分布。在64例结肠癌组织标本中，bcl?2蛋白表达阳性45例，阳性率为70.3%，在胞核或胞浆内呈灶状或弥漫分布的棕黄色颗粒。在结肠癌组织中bcl?2蛋白表达明显高于正常组织，二者有显著差异（P<0.05），见图3、图4、图6。
2.2 bag?1与Bcl?1表达与病理类型的关系 bag?1蛋白在46例腺癌中有29例阳性表达，阳性率为63.0%；在10例粘液癌中有7例阳性表达，阳性率为70.0%；在8例未分化癌中阳性表达有5例，阳性率为62.5%。经χ2检验，P>0.05，三者之间无显著差异。bcl?2蛋白在腺癌中有32例阳性表达，阳性率为71.1%，在粘液癌中有8例阳性表达，阳性率为80.0%，在未分化癌中，阳性5例，阳性率62.5%。经χ2检验，P>0.05，三者之间无显著差异，见表1。
表1 bag?1和bcl?2蛋白表达与结肠癌临床病理特征之间的关系（略）
2.3 bag?1和bcl?2的表达与结肠癌病理分级的关系 在18例高分化、18例中分化和10例低分化腺癌中，bag?1蛋白分别有6例、14例和9例阳性表达，其阳性表达率用χ2检验进行比较P<0.05，三者之间有显著性差异。在相应的高、中、低分化腺癌标本中，bcl?2的阳性表达结果经χ2检验P>0.05，三者之间无显著差异，见表1。
2.4 bag?1和bcl?2表达的相互关系 在64例结肠癌标本中，bag?1、 bcl?2共同阳性表达的有27例，共同阴性表达的有7例，通过对64例结肠癌标本中bag?1与bcl?2蛋白的平均阳性表达数进行相关系数分析，r＝0.475，二者成正相关。
3 讨论
bag?1基因是Takayama等1985的首先报道的一种抗凋亡基因，其分泌蛋白是一种已经被确认的多功能结合蛋白，它不属于bcl?2家族成员，但可与之相互结合，相互作用，增强其抗凋亡的能力［1?4］。bag?1在正常组织中几乎不表达，而在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、甲状腺癌及胃肠道恶性肿瘤中都有阳性表达［5，6］。Shou?Ching Tang［1］认为bag?1蛋白可以作为乳腺癌发病机理中的一种分子标记，并可作为影响乳腺癌预后的一项独立预后因素。Kikuchi等［7，8］的实验表明在结肠癌标本中bag?1在细胞核表达阳性的病人中，其伴有远处转移的比率要高于胞核表达阴性的病人，且其5年生存率要明显低于其他病人。本实验结果表明，bag?1在结肠癌组织中的阳性表达明显高于正常组织，且bag?1蛋白在结肠癌细胞的胞质和胞核都有阳性表达，这可能是由于bag?1 mRNA在翻译起始过程中产生两种主要的蛋白，其中短的蛋白分子（bag?1S）主要是存在于细胞质中，而长的蛋白分子（bag?1L）则主要定位于胞核，而本试验所用的多克隆bag?1抗体可以同时作用于这两种形式的bag?1蛋白分子［7］。bag?1的表达与结肠癌组织的细胞类型无关，而与结肠癌的病理分级密切相关，病理分级越高，其阳性表达率也越高，说明bag?1在肿瘤的发生及过程中都起着重要的作用，对bag?1的深入研究可能对结肠癌的早期诊断及预后产生深远的影响。
bcl?2是一种抗凋亡基因，其通过抑制细胞凋亡而参与肿瘤的发生，在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等多种肿瘤研究中，bcl?2与肿瘤的分级、分期及预后无关［10，11］。但国外国内也有部分研究认为bcl?2的表达与肿瘤的分级、分期及预后有关，这可能是应用了不同的免疫组织化学方法，不同的抗体及各地的实验室条件不同所导致。同时一些研究也认为bcl?2的表达是一些肿瘤产生耐药的机制之一［9］。本实验结果表明，bcl?2在各种细胞类型及病理分级的结肠癌组织中阳性表达率都很高，其间无显著差异，说明bcl?2的表达与结肠癌的细胞类型及病理分级没有明显相关性，bcl?2可能参与了结肠癌的发生过程，但可能与肿瘤的发展分化无关。
bag?1基因是一个正调节bcl?2抗细胞凋亡的蛋白，bag?1基因并非bcl?2家族成员的同源物，但其启动子区与bcl?2具有高度同源性，两者可以形成复合物，并相互作用，从而增强细胞抗凋亡的能力，其作用机制也许与影响蛋白质的稳定性有关［3，9，11］。
本研究发现，在结肠癌组织中，bag?1与bcl?2的阳性表达成正相关，表明结肠癌的发生发展是由多基因调控的，其中bag?1与bcl?2基因在其发病过程中发挥着重要作用，且它们之间具有相互增强的作用。研究探索它们在结肠癌发生发展过程中的作用，对结肠癌的早期诊断和指导有着重要的意义。
(本文图见第214页)（略）
【】
［1］ Shou?Ching Tang. Bag?1, An anti?apoptotic tumour marker［J］. IUMBM Life, 2002, 53(2): 99?105.
［2］Townsend PA, Cutress RI, Sharp A, et al. BAG?1: a multifunctional regulator of cell growth and survival［J］. Biochim Biophys Acta, 2003, 1603(2): 83?98.
［3］Ito Y, Yoshida H, Nakano K, et al. Bag?1 expression in thyroid neoplasm: its correlation with Bcl?2 expression and carcinoma dedifferentiation［J］. Anticancer Res, 2003, 23(1B): 569?576.
［4］Cutress RI, Townsend PA, Brimmell M, et al. BAG?1 expression and function in human cancer［J］. Br J Cancer, 2002, 87(8): 834?839.
［5］Turner BC, Krajewski S, Krajewska M, et al. Bag?1, a novel biomarker predicting long?term survival in early?stage breast cancer［J］. J Clin Oncol, 2001, 19(12): 992?1000.
［6］Noguchi T, Takeno S, Shibata T, et al. Nuclear BAG?1 expression is a biomarker of poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma［J］. Dis Esophagus, 2003, 16(2): 107?111.
［7］Kikuchi R, Noguchi T, Takeno S, et al. Nuclear Bag?1 expression reflcets malignant potential in clolrectal carcinomas［J］. British Journal of cancer, 2002, 87(11): 1136?1139.
［8］Kikuchi R, Noguchi T, Takeno S, et al. Immunohistochemical detection of menbrance?type?1?matrix metalloproteinase in colorectal carcinoma［J］. Br J Cancer, 2000, 83(3): 215?218.
［9］Takahashi N, Yanagihara M, Ogawa Y, et al. Down?regulation of Bcl?2?interacting protein BAG?1 confers resistance to anti?cancer drugs［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 301(3): 798?803.
[10]刘浩淼，朱朝晖，曾甫清，等. 膀胱移行细胞癌中P53突变Bcl?2的表达及其临床意义［J］. 中华实验外科杂志，2002，19（6）：125?127.
[10]Antoku K, Maser RS, Scully WJ Jr, et al. Isolation of Bcl?2 binding proteins that exhibit homology with BAG?1 and suppressor of death domains protein［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 286(5): 1003?1010.
