癌睾丸抗原基因的表观遗传改变及意义
【关键词】 癌睾丸抗原 表观遗传 肿瘤免疫
0 引言
肿瘤的发病和死亡率呈逐年上升趋势。多年的临床实践证明, 传统的肿瘤模式仍有很大的局限性。人们在对传统的肿瘤治疗模式进行反思的同时，开始探索新的肿瘤治疗模式，运用肿瘤细胞所特有的抗原进行免疫治疗就是其中的研究热点之一。在目前已知的众多肿瘤相关抗原中，癌睾丸抗原(Cancer Testis Antigen，CTA)由于其表达的特异性而适于作为肿瘤免疫治疗的靶抗原。本文仅从CTA的特点和表观遗传改变对CTA基因表达的调控及其意义做一综述。
1 CTA的特点
CTA是90年代以来发现的一类较新的肿瘤抗原，它们能在多种组织来源的肿瘤中表达，但在正常组织中的表达仅限于睾丸的生殖细胞，偶尔可在胎盘中表达。因为生殖细胞不表达HLA分子以及血睾屏障的存在，CTA在产生抗肿瘤免疫的同时不会对正常组织及生殖细胞产生危害，因此这类抗原又被视为具有肿瘤特异性。利用这一表达特性，目前一些CTA的疫苗已用于临床实验，如NY?ESO?1[1] 、MAGE[2]。归纳来看，CTA具有以下几方面的特点：（1）仅限于配子发育系统组织和肿瘤组织中表达;（2）其编码基因主要位于X染色体上；（3）多数CTA为多基因家族；（4）在肿瘤病人中具有免疫原性；（5)在不同的肿瘤组织中其表达率不同；（6）其表达与肿瘤的转移和恶化相关[3]。
在上述CTA的特点中，除了由于CTA表达率的差异能影响免疫治疗外，CTA的另一特点即在肿瘤中表达的异质性，也会影响CTA疫苗的疗效。越来越多的实验证明CTA在蛋白质水平表达具有异质性。Jungbluth等[4]分别运用MAGE?1和NY?ESO?1两种CTA的单克隆抗体进行免疫组化研究，发现MAGE?1和NY?ESO?1在非小细胞型肺癌中的表达率分别为95％和26％，但在这些阳性标本中，并不是所有的肿瘤细胞均表达相应CTA，仅5%～50％的肿瘤细胞表达。同样的情况也存在于其他CTA中，如SSX[5]、SCP?1[6]等。CTA在蛋白质水平表达的异质性对CTA疫苗的运用是一个很大的障碍，克服这一障碍除了联合运用多个CTA的疫苗外，还可以通过对CTA表观遗传的改变来诱导或增强CTA在肿瘤中的表达,目前有关这方面的研究已有报道。
2 表观遗传改变对CTA表达的调控及其意义
表观遗传改变（epigenetic alteration）指通过DNA自身化学修饰方式从转录水平影响基因的表达，但不存在DNA序列改变。表观遗传改变主要包括两个层面：DNA甲基化和组蛋白去乙酰化[7]。
2.1 表观遗传改变影响基因表达调控的机制
在高等真核生物中，DNA的甲基化指以S?腺苷?L?甲硫氨酸为甲基供体，在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化下将甲基转移到胞嘧啶的第5位C原子上。在CpG双核苷酸中，胞嘧啶环的第5位碳原子的甲基化是哺乳动物中最为重要的一种DNA修饰，约70％的CpG位点存在甲基化。在98％的DNA中，约每50～100bp出现一个CpG双核苷酸，它们呈高甲基化状态；而其余2％的DNA中，约每10bp出现一个CpG双核苷酸，它们则呈低甲基化状态，这部分DNA以约1kb片断散布于基因的启动子区域和第一个外显子[8]，又称CpG岛。目前认为DNA甲基化是基因表达调控的机制之一，主要通过以下三方面影响基因的转录：（1）甲基化改变了DNA分子的空间构象，从而影响基因表达 ；（2）基因启动子区域高甲基化状态直接阻碍转录因子与启动子的结合；（3）高甲基化的CpG岛通过特异的甲基化结合蛋白（Methyl?CpG?binding protein，Mecp）与组蛋白去乙酰化酶（Histone Deacetylase，HDAC）协同作用，增强HDAC去乙酰化的活性，从而导致基因转录失活[9]。由此可见，Mecp作为纽带将DNA甲基化和组蛋白去乙酰化这两种表观遗传化学修饰模式有机地结合起来，同时表观遗传改变影响基因表达调控并不仅限于DNA甲基化，组蛋白去乙酰化也是一个重要因素。
组蛋白乙酰化指在组蛋白乙酰转移酶的作用下，使核心组蛋白N?端区上特定的赖氨酸残基发生乙酰化反应。组蛋白乙酰化可以从以下两方面促进基因转录[10]：（1）转录活化因子如GCN5能识别氨基末端乙酰化的核心组蛋白，使染色质松弛，核小体DNA暴露，利于转录因子结合；（2）组蛋白乙酰化可干扰组蛋白氨基末端与抑制因子（如ISWI ATP酶）之间的相互作用。
2.2 表观遗传改变对CTA表达的调节
2.2.1 DNA甲基化对CTA表达的调节
目前已有不少实验证明，DNA甲基化在部分CTA的表达调控中起重要作用，其中对CTA中的MAGE家族研究较多。Honda等[11]用甲基化特异性PCR(Methylation?specific Polymerase Chain Reaction)和RT?PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) 方法，研究了胃癌细胞株中MAGE?A1和?A3基因启动子的甲基化及表达情况。结果发现，MAGE?A1基因启动子低甲基化状态存在于所检测的9个细胞株，而在这9个细胞株中仅两个为MAGE?A1表达阴性；同样，MAGE?A3基因启动子低甲基化状态也存在于九个细胞株中，其中仅有一个为MAGE?A3表达阴性，说明MAGE?A1和?A3启动子区域的甲基化状态影响它们在胃癌细胞株中的表达。除了对肿瘤细胞株中MAGE基因甲基化的研究外，也有对肿瘤组织的研究报道。利用同样的方法，Jang等[12]研究了MAGE?A1、?A3和?B2基因在原发性非小细胞型肺癌中的表达和甲基化情况。结果发现，癌组织中MAGE?A1、?A3和?B2的表达率和启动子低甲基化的百分率均高于癌旁组织，再次说明这些基因启动子区域的甲基化状态影响其表达。
在MAGE家族中，对基因甲基化状态研究较为深入的是MAGE?A1。最近研究发现[13]，MAGE?A1的激活与该基因转录起始点上、下游200～1 500bp区域的低甲基化水平有关，而且其上、下游30bp区域内CpG位点去甲基化是该基因转录激活的必须条件。此外，对其他一些CTA的甲基化如CAGE 也有研究。CAGE启动子中含16个CpG双核苷酸位点，Cho等[14]通过对不同肿瘤（如乳腺癌、胃癌、肺癌和肝癌等）细胞株和组织中这些位点进行分析，发现CAGE的表达和CAGE启动子甲基化也存在紧密联系。
2.2.2 DNMT抑制剂对CTA表达的影响
虽然目前对CTA基因具体位点甲基化的研究仅限于少数CTA家族，但通过DNMT抑制剂DAC来诱导CTA表达，从而探讨CTA基因甲基化与其表达之间的关系的研究,目前已在多种CTA中进行。在恶性间皮瘤中，其肿瘤细胞可表达多种CTA如MAGE?1～4、GAGE1?2、NY?ESO?1、SSX?2和SSX1?5，但MAGE?4和NY?ESO?1的表达频率不稳定，研究人员在肿瘤细胞的培养中加入DAC后，发现DAC可激活或上调上述CTA中的几种在不同肿瘤细胞株中同时表达[15]。此外Coral等[16]用DAC培养肾细胞癌 (Renal Cell Carcinoma，RCC)细胞后发现DAC能诱导所有的RCC细胞表达CTA中的MAGE?1～4、GAGE1?6和NY?ESO?1，其中NY?ESO?1的表达可持续至终止DAC培养细胞后60天，并使RCC细胞能被HLA?A2限制性CTL（Cytotoxic T Lymphocyte）识别。上述实验均证明DAC可在多种肿瘤中诱导多种CTA的表达，但是，DAC在诱导肿瘤细胞中CTA基因表达的同时，是否也能诱导正常体细胞中CTA基因的表达？如果诱导其表达，那么经CTA疫苗激活的特异性CTL在杀伤肿瘤细胞的同时，也可能对正常的体细胞起杀伤作用，给CTA的免疫带来严重的负面效应。为了更好地了解DAC的实际应用价值，Karpf等 [17]分别在肿瘤细胞和正常上皮细胞株的培养液中加入DAC，一定时段后收集这些细胞进行其整体基因表达的分析，发现DAC能诱导肿瘤细胞和正常细胞株中一些主要与增殖分化、免疫呈递和细胞因子等有关的基因表达，却不能诱导正常细胞表达CTA,说明DAC所诱导的表达有一定的选择性。因此， CTA疫苗配合DAC的使用，可用于解决CTA在多种肿瘤中存在着表达频率不高和表达异质性的难题，有助于提高肿瘤免疫治疗的疗效。
2.2.3 HDAC抑制剂对CTA表达的影响
目前，虽然表观遗传改变对CTA表达调控的研究主要集中在启动子的甲基化方面，但在组蛋白去乙酰化对CTA表达的调控方面也有所研究。Weiser等[18]研究了HDAC抑制剂能否加强DNMT抑制剂DAC对CTA的诱导表达作用。结果显示，单独使用DAC能诱导CTA中的NY?ESO?1在所培养的胸部肿瘤细胞中表达；单独使用HDAC抑制剂DP(depsipeptide FR901228)只能诱导无关基因的表达,但DP与DAC联合应用能增强DAC诱导的NY? ESO?1表达。除了研究NY? ESO?1外，他们还研究了DAC和DP对MAGE?3在肺癌和食管癌中表达的影响[19]。在分别用 DAC、DP及用两者联合培养肿瘤细胞后，与对照组相比，MAGE?3在mRNA表达水平分别增高了32倍(DAC组)、2.7倍(DP组)和37倍(DAC+DP组)，而且mRNA表达水平增高的倍数与蛋白质表达水平相一致。以上实验说明，DNA甲基化与组蛋白去乙酰化并非两个相互独立的基因表达调控机制，它们之间具有协同作用。
3 结束语
综上所述，CTA独有的表达特异性使其成为肿瘤免疫治疗中极具潜力的靶抗原，然而CTA在一些肿瘤中表达率不高以及表达异质性的存在又会影响其在肿瘤免疫治疗中的效果。已有研究表明，表观遗传改变对CTA的表达具有重要的调控作用，因此系统合理地应用能改变表观遗传的药物，提高CTA表达率，减弱其在肿瘤中表达的异质性，有助于提高肿瘤细胞的免疫原性，促进CTL对肿瘤细胞的免疫识别和杀伤。因此，进一步深入CTA表观遗传改变对其表达调控影响的研究，为改变表观遗传的药物在CTA抗肿瘤免疫治疗中的应用提供理论基础，有助于提高CTA疫苗在肿瘤免疫治疗中的疗效。
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