分类表达谱基因芯片在医学研究中的应用
【关键词】 基因芯片 分类 应用 肿瘤
0 引言
随着基因芯片制备技术的提高，高密度的探针阵列使得生物体的基因表达情况只用一块芯片即可包括。分类表达谱基因芯片在设计时先对基因进行有目的的筛选与分类，因而更具有针对性。现在已经上市的产品种类涵盖了生命研究的各个方面,其中包括:细胞凋亡基因芯片[1，2]、细胞周期基因芯片[3，4]、肿瘤基因芯片[5，6]、常见疾病研究芯片、细胞因子与炎症反应芯片[7，8]、细胞外基质与粘连分子芯片[9，10]、神经科学芯片[11]、信号传导芯片[12]、干细胞芯片[13]、毒理和药理芯片等。现就几种常用的分类表达谱基因芯片构成和应用综述如下。
1 人细胞凋亡基因芯片
美国Affymetrix公司研制的人细胞凋亡芯片含细胞凋亡相关基因458个，这些基因根据它们的结构与功能分成TNF配体家族（LTA、LTB、TNF、FasL、TRAIL、Apo3L、APRIL等）、TNF受体家族（LTBR、TNFR1、OX40、CD40、Fas、DR4、HVEM等）、bcl?2 家族（BAD、BAK1、BAX、BCL2、bcl?x、BIK、HRK等）、Caspase家族（CASP1?14）、IAP 家族（BIRC1、IAP2、XIAP、survivin等）、Calpains以及其他细胞凋亡相关的蛋白、老化与衰老相关蛋白等[15]。该芯片可以用于细胞凋亡的分子机制、细胞凋亡与肿瘤的关系、衰老的机制与寿命的延长、相关药物的研制与开发以及其他与细胞凋亡有关领域的研究[1,2]。
2 人肿瘤药物耐受和代谢基因芯片
肿瘤细胞多药耐药性（multidrug resistance, MDR）是造成化疗失败的重要原因，耐药的机制虽有很多，但起来不外乎是肿瘤细胞内各种耐药相关转运蛋白和酶类量的改变。而这种量的改变是由编码这些转运蛋白和酶类的耐药相关基因过度表达或表达下调造成的。
人肿瘤药物耐受和代谢基因芯片是研究MDR的一种强有力的工具，它包含机体对化疗反应的各种基因。这些基因要么编码耐药相关的转运蛋白和酶类，要么是DNA修复和耐药的调节基因。主要有：耐药相关基因（MDR1、MRP1?6、BCRP、BAX、BCL2、LRP、RB1、TOP1、TOP2A、TOP2B、TP53等）、药物代谢基因（ARNT、BLMH、COMT、SOD1、STE等）、DNA修复基因（APC、BRCA1、MGMT、MLH1、XPA等）、细胞周期基因（CCND1、CDK2、CDK4、p21Waf1、p27Kip1、p16Ink4等）、生长因子受体基因（EGFR、ERBB2、FGF2、MET等）、激素受体基因（AR、ESR1、ESR2、PPARD、PPARG等）、转录因子基因（AHR、AP1S1、ELK1、FOS 、MAFB、MYC、NFKB1、NFKB2等）[16]等。利用分类表达谱芯片探讨MDR的不同参与机制，寻找耐药相关的靶基因、靶蛋白，设计合理的逆转策略，才能减少盲目性，提高预见性，为肿瘤的化疗开创新的前景，提高肿瘤患者的生存期和存活率。
3 人肿瘤信号传导基因芯片
肿瘤的信号传导同样是一种非常复杂的过程，美国的SuperArray公司研制的人肿瘤信号传导基因芯片可以为这方面的研究提供帮助。芯片包含96个基因，这些基因是与肿瘤发生有关的15条信号传导通路的重要参与者。包括雄激素/雌激素通路相关基因（CDK2、 p21Waf1、EGFR、BCL2、BRCA1、PGR等）、Cox?2通路相关基因（FOS、HSPA4、MCL1、PPARG、PTGS2等）[17]、DNA 损伤 / p53通路相关基因（BAX、GADD45A、HIF1A、IGFBP3、MDM2、PIG3、WIG1等）、低氧通路相关基因（EDN1、EPO、HK1、TFRC等）、炎症 / NFkB通路相关基因（ICAM1、IL2、NOS2A、TNF、VCAM1等）、MAP激酶通路相关基因（COL1A1、EGR1、FOS、JUN等）[18]、PI?3激酶/ AKT通路相关基因（CCND1、FN1、HIF1A、MYC 等）、STAT通路相关基因（A2M、CSN2、IL4、IRF1等）、应激 / 热休克通路相关基因、应激/ p38 & JNK通路相关基因、survival / NFkB通路相关基因、TGFβ通路相关基因和Wnt通路相关基因[12，14]。
4 人干细胞基因芯片
人胚胎干细胞是现在医学研究的热点，在这方面的研究中可以应用人干细胞基因芯片。此芯片是由美国老年研究所干细胞生物学部和SuperArray公司联合研制开发的。它包含266个已知基因，其中有干细胞在分化各个时期表达的标志物基因（86个）[19]、调节干细胞生长的生长因子和细胞因子基因（96个）[20]、干细胞在不同时期表达的细胞外分子基因（36个）、干细胞分裂过程中的调节基因以及阳性对照和管家基因。除应用于胚胎干细胞、中胚层干细胞和造血干细胞鉴定与分化研究外，此分类表达谱基因芯片尤其适用于神经干细胞发育研究[13]。
此外对于各种常见疾病，也有相应的分类表达谱基因芯片。人动脉粥状硬化疾病基因芯片共包含192个基因，具体包括：粘附相关基因（ICAM1、ITGA1?10、ITGAM、ITGB1?8、SELE、SELL、VCAM1等）[21]、炎症相关基因（CCL2、CCR1、CSF1?3、DSCR1、IFNG、IL1A、IL2?8、 LIF、NFKB1、TNF等）、凋亡相关基因（BAX、BCL2、BCL2A1、BID、FLIP、MKP3、Fas等）、胞外转运蛋白相关基因（APOA1?5、APOB、APOC1?3、APOD、LPA等）、胆固醇和脂质转运及代谢相关基因（ABCA1、ADFP 、CD36、MSR1、OLR1等）、生长相关基因（CTGF、EGR1、FGF2、KDR、TGFB1?3、VEGF等）、应激相关基因（HspB、KLF2、NOS3、Cox?1、SOD1、SOD2等）[22]等。对动脉粥状硬化发生过程中基因表达改变的了解将有助于预防和早期诊断各种心脑血管疾病。
分类表达谱基因芯片主要应用于以下几个方面的研究。
4.1 基因表达分析
分类表达谱基因芯片主要应用于基因表达的分析，包括差异表达检测、表达随时间的演变分析、发现未知基因的表达等。
4.1.1 基因差异表达检测 目前基因差异表达研究方法主要有表达序列标签测序、差减克隆、差异显示、基因表达系列分析等。而表达谱基因芯片可以同时监测成千上万的基因，为基因功能的研究提供了极大便利。Tanaka等[23]应用Affymetrix公司研制的包含2 000 肿瘤相关基因的肿瘤表达谱芯片，分析了高度转移性胰腺癌细胞与其亲代细胞基因表达的差异，寻找出了20个表达上调的基因和5个下调基因，提示这些表达存在差异的基因可能与胰腺癌的转移有关。Luo等[24]利用包含500个细胞周期调节、凋亡、生长和分化等基因的分类芯片比较了胚胎神经上皮细胞(NEPs)与其祖细胞基因表达的差别，发现152个基因在NEPs中表达，209个基因在其祖细胞中表达，141个在两者中都有表达，68个只在祖细胞中表达。从而阐明了NEPs与其祖细胞在早期分化阶段基因表达谱的差异。
4.1.2 分析基因表达随时间的演变 Iyer等[25]用成纤维细胞特异性表达谱芯片，对成纤维细胞中与细胞增生和损伤修复有关的基因进行了分析。细胞被置于无营养的环境中，使绝大部分基因的活性关闭，再加入10%的血清，观察基因的活化情况。试验结果表明，在所有被监测的基因中，约有500个基因最为活跃。其中，最早被活化的是转录调控基因。在活化的基因中，28个与细胞增殖有关；8个与免疫反应的激活有关；19个与血管重建有关。提示在不同因素影响下，细胞中基因的表达存在一定的先后次序。基因表达随时间演变的研究有助于细胞分化调控、生物进化演变等问题的阐明。
4.1.3 发现新基因的表达 Moch等[26]利用肿瘤特异性表达谱芯片发现了肾细胞癌的肿瘤标志物基因，并与正常细胞进行了比较，在532份标本中检测到胞浆纤维Vimentin的表达，阳性率为51%～61%。追踪观察发现有Vimentin表达的患者，预后极差。Grutzmann等[27]在寻找胰腺导管腺癌(PDAC)分子标志物的研究中应用了Affymetrix 公司3023点的肿瘤分类芯片，发现了81个PDAC与正常胰腺导管上皮差异表达的基因。26个在PDAC中表达下调，14个上调。在这81个基因中15个为已知与PDAC发生有关的基因，其余为新发现的基因。
4.2 基因突变分析
基因突变往往与个体的不同性状和多种疾病密切相关，利用分类表达谱芯片可以对不同基因的突变情况进行检测。Takahashi等[28]利用p53分类表达谱芯片检测了20例结肠癌手术标本p53基因外显子2－11的突变情况，发现65%的原发结肠癌存在p53基因的突变，61%的突变位置在保守区域，46%的突变位置在锌指结合部位。
4.3 疾病的诊断
人类的疾病往往与遗传密切相关，分类表达谱基因芯片可以对遗传信息进行快速准确的分析，因此它在疾病分子诊断中的优势是不言而喻的，已经被应用于感染性疾病、肿瘤等方面的研究。
4.3.1 肿瘤的诊断 人类恶性肿瘤中，约有60%与人类p53抑癌基因的突变有关，目前研究人员已经研制成功了可以检测p53基因所有编码区（外显子2～外显子11）错意突变和单碱基缺失突变的分类表达谱基因芯片。以外显子7的第248个密码子为例，野生型为CGG，在芯片上做出5条探针，相应位点分别为GAC、GCC、GGC、GTC和G?C，根据杂交后的荧光显色图，就可以分析出该位点为何种突变。用Affymetrix p53芯片和PCR?SSCP调查42例有乳癌史的家系，p53基因13964位的G突变为C，突变率为7.1%，无乳癌家族史者为0。
4.3.2 耐药菌株和药敏检测 据WHO报告，全球每年约有800万结核病患者，有300万人死亡，死亡人数超过了艾滋病和疟疾的总和。主要原因是菌株对不同的药物产生了抗药性。对每例患者进行菌株和药敏鉴定是控制TB的关键。同样可以应用具此功能的分类表达谱芯片，对耐药情况作出诊断，使用敏感药物。
4.4 药物研发
4.4.1 调查药物处理细胞后基因的表达情况 关于肠癌患者化疗前和期间肿瘤基因表达情况的研究发现，丝裂霉素C和5?氟尿嘧啶治疗可使糖苷合成酶和尿嘧啶?DNA糖基酶的基因表达增加。Sun等[29]在抗HIV制剂 MAP30调节BC?2细胞增殖和凋亡基因表达的研究中，应用了信号传导表达谱芯片，发现BC?2细胞egr?1、ATF?2、hsp27、 hsp90、IkappaB、mdm2、skp1和IL?2基因表达上调，MAP30通过NfkappaB和p53信号传导通路抑制凋亡。首次发现了细胞中参予AIDS相关肿瘤发生的特异性信号传导通路，并初步阐明了MAP30抗Kaposi肉瘤的分子机制。这类研究有助于阐明药物的作用机制，确定药物作用的靶基因，为新药研发提供线索。
4.4.2 对药物进行毒性评价 应用分类表达谱芯片可以查找药物的毒副作用，进行毒研究。慢性毒性和副作用往往涉及基因表达的改变，如果药物能抑制重要基因的表达，则对它的深入研究就值得考虑。用芯片作大规模的表达研究往往可省略大量的动物试验。有学者研制了包括涉及细胞凋亡、DNA复制和修复、氧化应激/氧化还原内稳态、过氧化物酶体增殖反应、二恶英/多环芳烃反应、雌激素反应、看家基因、癌基因和抑癌基因、细胞周期控制、转录因子、激酶、磷酸酶、热休克蛋白、受体、细胞色素P450等共2090个基因的毒理芯片,该芯片既可用于毒物和基因多态性的检测，又可用于受检毒物毒性作用机制的研究。还有研究者从人和小鼠文库中选择约600个与毒理学相关基因的cDNA克隆，制备了种属特异的毒理基因组学芯片，可研究肝脏毒性、内分泌干扰、致癌作用等毒性的作用机制，也可用于确定以基因表达模式为基础的化合物的毒性。
分类表达谱基因芯片在中医学领域中如：中药、中医理论、针灸原理等研究方面也有广阔的应用前景。
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