抑制PI3K/Akt通路提高HeLa细胞化疗效果的实验研究
【摘要】 目的 探讨抑制PI3K/Akt信号转导通路提高抗癌药物对人宫颈癌HeLa细胞的杀伤作用。方法 采用MTT法检测Celecoxib、DDP及Docetaxel单独或联合PI3K抑制剂LY294002对人宫颈癌HeLa细胞的抑制率；采用流式细胞技术检测药物单独或联合作用对HeLa细胞凋亡的影响。结果 （1）联合LY294002能够显著提高Celecoxib、DDP及Docetaxel对HeLa细胞抑制率；（2）LY294002与Celecoxib、DDP及Docetaxel的协同指数均小于1，二者起协同治疗作用；（3）联合LY294002能够增加HeLa细胞的凋亡水平。结论 抑制PI3K/Akt信号转导通路能够显著提高Celecoxib、DDP及Docetaxel对HeLa细胞杀伤作用。
【关键词】 PI3K/Akt 协同治疗指数 细胞凋亡
0 引言
近年的研究表明，磷脂酰肌醇?3激酶（phosphatidylinositol?3?kinases，PI3K）在肿瘤信号转导中起着重要的调节作用。细胞在一系列内外因素的作用下，通过启动PI3K/Akt信号转导通路，诱导细胞的增殖、分化，避免细胞发生凋亡。在肿瘤细胞逃避抗癌药物的杀伤过程中，PI3K/Akt信号转导通路可能起了极其重要的作用，因此PI3K/Akt信号转导通路有望成为恶性肿瘤治疗的新靶点。我们进行了PI3K抑制剂联合抗癌药物对肿瘤细胞杀伤作用的研究。
1 材料与方法
1.1 材料
人宫颈癌细胞系HeLa细胞为本研究室保存。PI3K抑制剂LY294002购自美国Cell Signaling公司； 多西紫杉醇（Docetaxel）由法国罗纳普朗克?乐安公司生产；顺铂(DDP)由江苏豪森药业股份有限公司生产；塞莱西布（Celecoxib）由合肥森瑞化工有限公司生产。RPMI1640培养基购自美国Hyclone公司。FACSort流式细胞仪为美国Becton Dickson公司产品。
1.2 细胞培养
HeLa细胞由含有10%新生牛血清的RPMI1640培养液于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱培养，实验使用细胞均为接种后24h处于对数生长期细胞。
1.3 细胞抑制率测定
采用MTT法检测HeLa细胞的抑制率。取对数生长期细胞消化制成细胞悬液，按103～104/孔，每孔200μl接种96孔细胞培养板。37℃、5%CO2饱和湿度培养24h后，加入不同浓度药物，每个样本设8个平行孔。LY294002的终浓度为5，10，20，40，80μM，DDP的终浓度为5，10，20，40，80μg/ml，Celecoxib的终浓度为80，100，120，140，160μmol/L，Docetaxel的终浓度为0.1，0.5，1，5，10μg/ml。两药合用（DDP+LY294002，Celecoxib+LY294002，Docetaxel+LY294002）药物浓度采用1∶1方案。设空白孔对照，给药后继续置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养24h，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl培养4h，彻底吸去培养液，加入二甲基亚砜150μl/孔，震荡10min，酶标仪492nm激光检测吸光度。细胞抑制率（抑制率=1－加药物孔的吸光度值/未加药物孔的吸光度值×100%）。实验重复3次。
1.4 结果判定
根据周廷潮等［1］药物效应中效方程式 fa/fu = ( D/Dm )m，进行中效作图y=logfa/fu，x=log D，y=ax+ b（fa为效应，fa=抑制率，fu为1?fa，D为药物浓度，Dm为中效剂量，即0.5效应时的药物浓度，m为斜率)。计算两药单用及合用时的中效浓度（IC50）。然后根据公式计算合用指数（combination index，CI）CI=(D)1/(DX)1+(D)2/(DX)2+α〔(D)1 (D)2〕/〔(DX)1(DX)2〕，(D)1 、(D)2为联合用药达到某一效应时药物1和药物2的浓度，(DX)1、(DX)2为单独用药达到某一效应时药物1和药物2的浓度，α=1为两种相互非排斥性药物，α=0为两种相互排斥性药物。CI＜1协同，CI=1相加，CI＞1拮抗。
1.5 细胞凋亡检测
分别Celecoxib 80μmol/L，DDP 10μg/μl，Docetaxel 1μg/μl ，LY294002 20μM单独及两药联合（Celecoxib 80μmol/L + LY294002 20μM，DDP 10μg/ml + LY294002 20μM，Docetaxel 1μg/ml + LY294002 20μM）作用细胞24h后，制成细胞悬液1000r/min离心5min收集细胞，0.01mol/l PBS液冲洗2次，用?20℃80%乙醇固定细胞，细胞悬液1 000r/min离心5min，去掉乙醇固定液，PBS液洗涤2次，调整细胞浓度为5×105/ml，加入PI染液1ml（50μg/ml PI，100μg/mlRNase，0.1%Triton?100），4℃孵育60min，200目钢筛过滤，流式细胞术分析细胞周期和凋亡。
2 结果
2.1 单药及两药合用细胞抑制率改变
表1 HeLa细胞药物单独及联合作用对细胞半数抑制浓度的影响（略）
联合用药组LY294002联合Celecoxib、DDP及Docetaxel的半数细胞抑制浓度（IC50）均显著高于单独用药组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。所有联合用药组CI均<1，说明LY294002与Celecoxib、DDP及Docetaxel起协同作用，见表1。
2.2 单药及两药合用细胞对细胞凋亡的影响
联合用药组LY294002联合Celecoxib、DDP及Docetaxel引起的细胞凋亡改变均显著高于单独用药组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。其中LY294002联合Celecoxib、DDP能够显著引起人宫颈癌HeLa细胞凋亡，见表1、图1。
图1 HeLa细胞抗肿瘤药物单独和与LY294002联合应用细胞凋亡变化 （略）
A：单独应用DDP作用；B：DDP与LY294002联合作用。M1 细胞凋亡比例；M2 G0/G1期细胞比例；M3 S期细胞比例；M4 G2/M期细胞比例。
3 讨论
化疗是目前恶性肿瘤的重要手段，但是肿瘤细胞通过一系列适应性反应逃避抗肿瘤药物对其的杀伤作用。引起肿瘤细胞耐药的机制很多，其中磷脂酰肌醇?3激酶（phosphatidylinositol?3?kinases，PI3K）起了非常重要的作用。作为细胞生长、增殖和抗凋亡的重要调节因素，PI3K/AKT信号转导通路在引起恶性肿瘤化学治疗和放射治疗抗拒中起着非常重要的作用。研究发现，PI3K/AKT的抑制因子PTEN突变或缺失的胰腺癌细胞对放化疗敏感性差［2］。Clark等［3］在乳腺癌的研究中发现，化疗药物和Tamoxifen均能显著通过激活PI3K提高活化的AKT的水平，导致细胞对化疗药物和Tamoxifen产生抗拒。Shingu等［4］对恶性胶质瘤的研究中也发现，PI3K/AKT通路的激活使胶质瘤细胞产生明显的放化疗抗拒。
本实验研究发现，联合LY294002和Celecoxib、DDP及Docetaxel能够显著地提高DDP、Celecoxib及Docetaxel对人宫颈癌HeLa细胞的抑制效率，同时联合作用能够增加HeLa细胞的凋亡。这说明抑制PI3K/AKT信号转导途径可以增强Celecoxib、DDP及Docetaxel对人宫颈癌HeLa细胞的杀伤作用，PI3K/AKT信号转导途径的活化可能是导致肿瘤细胞发生耐药的一个重要原因。目前研究推测原因可能为：（1）化疗药物诱导肿瘤细胞中的ras癌基因表达增加，ras蛋白激活PI3K/AKT通路，使细胞产生化疗抗拒［5］；（2）化疗药物激活细胞蛋白酪氨酸激酶受体家族（包括EGF受体家族、PDGF受体家族、VEGF受体家族）和NF受体家族、IGF受体家族，活化PI3K/AKT通路，使细胞产生放化疗抗拒，抑制IGF受体家族能够减少PI3K/AKT通路的活化，增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［6］。
PI3K/Akt信号转导途径抗细胞凋亡作用可能与下面几种机制有关：调节bcl?2家族成员的活性，促进bcl?2 发挥抗凋亡作用［7］；抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族成员的活化；抑制FKHR进入细胞核诱导FasL的表达，从而抑制细胞凋亡［8］；防止线粒体释放细胞色素C及凋亡因子［9］。本研究中也发现，联合应用LY294002能够显著地增加宫颈癌HeLa细胞的凋亡率，这说明抑制PI3K/Akt信号转导途径能够有效地提高药物诱导的肿瘤细胞的凋亡。
近年来的研究认为，多途径多步骤的杀伤肿瘤细胞和抑制肿瘤的生长是提高肿瘤治疗效果的重要方法。由于PI3K/Akt信号转导通路在恶性肿瘤细胞中的过度活化，因此抑制PI3K/Akt信号转导通路联合抗肿瘤药物提高肿瘤细胞化疗效果的有效方法及其机制是值得我们继续研究的。
【】
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