三氧化二砷对人大肠癌细胞生长及其端粒酶活性的影响
【关键词】 三氧化二砷
The Influence of Arsenic Trioxide on the Growth and Telomerase Activity of Human Large Intestine Carcinoma Cells
Abstract：Objective To study the influence of arsenic trioxide on the growth and telomerase activity of human large intestine carcinoma cell lines. Methods The influence of growth on human large intestine carcinoma cell lines LoVo and CoLo?320 induced by As2O3 injection was analyzed by observing living cells method, Trypan blue method, 3?(4,5? dimethylthiazole?2?yl)?2, 5?diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay. Telomerase activity of the carcinoma cells was measured by the method of repeat amplitication protocol (TRAP) combining with polyacrylamide gel electrophosis (PAGE) silver staining method before and after the treatment with As2O3 injection. Results As2O3 injection could strongly inhibit the growth of human large intestine carcinoma cell lines LoVo and CoLo?320.Also the tolemerase activity of LoVo and CoLo?320 treated by As2O3 injection was inhibited obviously, which showed both dose?dependent and time?dependent relationship. Conclusion As2O3 has significant inhibition effect on the human large intestine carcinoma cell lines, which maybe closely related to As2O3 's inhibiting effect on the carcinoma cell tolemerase activity.
Key words：Large Intestine Carcinoma; Cell Lines; Arsenic Trioxide; Tolemerase
摘要：目的 探讨三氧化二砷（As2O3）注射液对人类大肠癌细胞生长及其端粒酶活性的影响。方法 采用活细胞观察法、台盘兰拒染法和四甲基偶氮唑蓝比色（MTT）法，严密观察As2O3注射液对人大肠癌细胞株LoVo和CoLo?320生长的影响；应用端粒重复序列扩增法（TRAP）—聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）银染法检测As2O3注射液处理前、后大肠癌细胞端粒酶活性的变化。结果 As2O3注射液能够显著地抑制LoVo和CoLo?320细胞株的生长，并对癌细胞的端粒酶活性具有明显的抑制作用，该作用呈现出一定的浓度和时间依赖性。结论 As2O3注射液的确对于人大肠癌细胞株的生长具有显著的抑制作用，该作用可能与As2O3注射液能够抑制癌细胞的端粒酶活性密切相关。
关键词：大肠癌；三氧化二砷；细胞株；端粒酶
0 引言
三氧化二砷（As2O3）是剧毒中药砒霜的有效成分,自 20世纪70年代以来，我国学者率先研制成功As2O3注射液，用于急性早幼粒细胞白血病(APL)，取得了世人瞩目的突破进展[1?5]。近年来，应用As2O3注射液治疗多种实体瘤的实验和临床研究方兴未艾，受到了广泛重视[6?8]。2004年11月经国家食品药品监督管理局（SFDA）批准增加了As2O3注射液可用于治疗晚期原发性肝癌，从而显示出更为广阔的应用前景。为了积极拓展As2O3注射液治疗其他消化道肿瘤的适应证，我们课题组业已开展该药在体内、外抗大肠癌作用的一系列实验研究，初步结果十分令人鼓舞[9,10]。本实验以两株离体人大肠癌细胞LoVo和CoLo?320为研究对象，严密观察了As2O3注射液体外对人大肠癌细胞生长及其端粒酶活性的影响，现报告如下：
1 材料和方法
1.1 细胞株
人大肠癌细胞株LoVo和CoLo?320，均引自院上海细胞生物研究所细胞库。
1.2 主要试剂
1g/L As2O3溶液，即亚砷酸注射液(哈尔滨伊达药业公司产品，批号20001102)。四甲基偶氮唑蓝（MTT）， 购自Fluka公司。银染?TRAP试剂自配。Ts引物序列为5’AATCCGTCGAGCAGAGTT3’，Cx引物序列为5’CCCTTACCCTTACCCTTACCCTA A3’,均由中科院上海细胞生物研究所合成。CHAPS购于Sigma公司,TaqDNA多聚酶购于Promega公司。聚丙烯酰胺为E?MERCK公司产品。
1.3 细胞培养
将LoVo和CoLo?320细胞株接种于无菌培养瓶中，加入含小牛血清、青链霉素的培养液，于培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，每3～4d传代一次。
1.4 活细胞观察
在培养状态下,在倒置显微镜下观察细胞用药前后生长状况及其形态学改变。
1.5 台盘兰拒染法检测细胞增殖率
癌细胞悬液以2×107/L浓度接种于40孔细胞培养板中，待细胞贴壁后分别加入不同浓度的As2O3注射液,对照孔加培养液,培养至预定时间，以0.5%台盘兰染液染色5min,显微镜下出拒染的活细胞数,按下式计算细胞增殖率:细胞增殖率=(给药组平均活细胞数/ 对照组平均活细胞数)×100%
1.6 MTT法检测细胞增殖率
将浓度为2×107/L癌细胞接种于40孔细胞培养板中，待细胞贴壁后分别加入不同浓度的As2O3注射液,对照孔加培养液,培养至预定时间，每孔加入MTT,继续培养4h,加盐酸异丙醇,于酶联仪波长570nm处测出各孔吸光度值(A值),按下式计算细胞增殖率: 细胞增殖率=(给药孔平均A值/对照孔平均A值)×100%
1.7 端粒酶活性的检测
将对数生长期癌细胞制成细胞悬液，取细胞悬液3.6ml（含1×106个细胞）接种培养瓶中，待细胞贴璧后加入不同浓度的As2O3注射液，作用48～120h后收集细胞备用。取阳性对照细胞悬液（含1×106个细胞），接种于培养瓶中，培养48h后收集细胞备用。细胞吸干后加细胞裂解液，提取上清液保存备用。取出1 μl上述细胞提取液，加入TRAP反应液中，温度为30℃，反应30min。加Cx引物（0.1μg/ml）1μl，进行PCR扩增。然后加5μl溴酚蓝于反应管中。取PCR扩增产物25μl，在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，取下凝胶用双蒸水漂洗后，乙醇固定、硝酸脱色、硝酸银染色、3％碳酸钠显色，直至产物条带足够强而背景不致过深为止。最后用冰醋酸固定、拍照，同时设阳性对照为Hela细胞，阴性对照为细胞裂解液（替代细胞提取物）。
1.8 统计方法
统计学变量均以均数±标准差（±s）表示，以P<0.05为有统计学意义；采用完全随机设计的方差分析进行显著性检验；上机以SAS9.1软件进行数据处理。
2 结果
2.1 活细胞观察
在倒置显微镜下，观察到As2O3注射液在体外可以明显抑制癌细胞株LoVo和CoLo?320的生长。用药组的癌细胞逐渐变圆、脱壁，细胞间接触变松，胞浆中颗粒增多，增殖变慢，细胞周围碎片增多；而未加药的对照组癌细胞呈上皮型贴壁生长，细胞轮廓清楚，细胞间接触紧密，细胞生长旺盛，见图1～4。
2.2 台盘兰拒染法测定细胞增殖改变
应用As2O3注射液处理后， LoVo和CoLo?320癌细胞的增殖均受到不同程度抑制，其抑制作用随药物浓度增加和作用时间延长而增强。用不同浓度As2O3作用LoVo和CoLo?320细胞相同时间以及相同浓度As2O3处理不同时间的细胞增殖受抑情况相比,均有显著差异性(P<0.05)，见表1、2。
表1 不同浓度As2O3注射液对LoVo细胞增殖的影响（台盘兰拒染法）（略）
注：与0.5 mg·L-1组比，aP<0.5；与1.0 mg·L-1组比，bP<0.5；与2.0 mg·L?1组比，cP<0.5；与24h组比，dP<0.5；与48h组比，eP<0.5
表2 不同浓度As2O3注射液对CoLo?320细胞增殖的影响（台盘兰拒染法）（略）
注：与0.5 mg·L?1组比，aP<0.5；与1.0 mg·L?1组比，bP<0.5；与2.0 mg·L?1组比，cP<0.5；与24h组比，dP<0.5；与48h组比，eP<0.5；
2.3 MTT比色法测定细胞增殖改变
加入不同浓度As2O3注射液，对LoVo和CoLo?320细胞作0～72h培养，结果细胞增殖均受到不同程度抑制，此抑制作用与药物浓度和作用时间均呈明显的依赖关系，见图5、6。
图5 As2O3注射液对LoVo细胞增殖的影响（略）
图6 As2O3注射液对CoLo?320细胞增殖的影响（略）
2.4 端粒酶活性分析
4mg/L As2O3注射液处理LoVo和CoLo?320癌细胞48h、72h，以及8mg/L As2O3处理48h时，端粒酶活性表达仍为阳性；而4mg/L As2O3处理120h、8mg/L As2O3处理72h 和120h时端粒酶活性表达变为阴性，提示As2O3注射液对人大肠癌细胞端粒酶活性具有抑制作用，该作用具有浓度和时间依赖性，见图7、8。
图7 As2O3对LoVo细胞端粒酶活性的影响（略）
1. 阴性对照;2. 阳性对照；3. 4mg/L As2O3作用48h；4. 4mg/L As2O3作用72h；5. 4mg/L As2O3作用120h；6. 8mg/L As2O3作用48h；7. 8mg/L As2O3作用72h；8. 8mg/L As2O3作用120h
图8 As2O3对CoLo?320细胞端粒酶活性的影响（略）
1. 4mg/L As2O3作用48h；2. 4mg/L As2O3作用72h；3. 4mg/L As2O3作用120h；4. 8mg/L As2O3作用48h；5. 8mg/L As2O3作用72h；6. 8mg/L As2O3作用120h；7. 阴性对照;8. 阳性对照
3 讨论
端粒是真核生物染色体线性DNA分子末端的特殊结构，对维持染色体稳定性和DNA完整复制具有重要作用。随着细胞分化和发育过程的进行，端粒DNA越来越短以至消失，造成染色体不稳定，从而使细胞死亡。端粒酶是维持端粒长度的逆转录酶，以自身RNA为模板合成端粒重复序列。端粒酶是一种核糖核蛋白，由端粒酶RNA成分、催化亚单位和端粒酶相关蛋白三部分组成。端粒酶通过合成新的端粒，从而保证端粒DNA不会随细胞分裂而缩短。研究发现，恶性肿瘤的发生、与端粒、端粒酶密切相关，在正常体细胞中端粒酶活性很低，而恶性细胞中却有很高的端粒酶活性。因此，以抑制端粒酶活性为靶点的抗肿瘤已成为新的研究热点[11,12]。
近年研究表明，As2O3可能为多靶点抗肿瘤药，作用机制复杂，包括对肿瘤细胞的细胞毒（原浆毒）作用、诱导肿瘤细胞凋亡和分化、抑制肿瘤细胞端粒酶活性、抗肿瘤血管形成以及对肿瘤细胞的基因调控作用等[13?15]。我们的实验结果已发现，As2O3注射液在体外具有显著抗大肠癌作用，其作用机制包括细胞毒作用、诱导癌细胞凋亡、调控癌细胞生长周期和凋亡相关基因表达。本研究进一步观察了As2O3注射液体外对人大肠癌细胞增殖和端粒酶活性的影响。结果表明，As2O3注射液可以显著地抑制体外人大肠癌细胞LoVo和CoLo?320的增殖，并呈量效和时效特点；4 mg/L As2O3注射液作用48h和72h、8 mg/L As2O3注射液作用48h均不能抑制人大肠癌细胞LoVo和CoLo?320的端粒酶活性，而4 mg/L As2O3注射液作用120h和8 mg/L As2O3注射液作用72h和120h，即可完全抑制LoVo和CoLo?320细胞的端粒酶活性，提示As2O3注射液体外具有抑制人大肠癌细胞端粒酶活性的作用，此作用具有剂量和时间依赖性。
本研究证实，As2O3注射液在体外具有显著抗大肠癌作用，而抑制癌细胞端粒酶活性可能是其抗肿瘤作用机制之一，因此为应用As2O3注射液治疗大肠癌和其他恶性肿瘤提供了比较可靠的实验依据。
（本文图1～4见封3）（略）
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