Snail／GST融合蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

         作者：张儒英，云昆仑，乔惠珍，王冰晶，张志谦   

【关键词】  Snail；融合蛋白；多克隆抗体

    0  引言

    上皮型钙粘附素（E?cadherin，E?cad）介导的粘附系统的破坏，是肿瘤从非浸润性转化为浸润性的关键步骤［1］。而锌指转录因子Snail，具有下调E?cad的作用［2］，本研究通过制备Snail抗体，为进一步开展E?cad的功能研究和应用奠定了基础。

    1  材料和方法

    1.1  主要试剂和菌株  主要试剂购自北京中山公司；大肠杆菌DH5a和BL21由北京大学临床肿瘤学院北京市肿瘤防治研究所细胞实验室保存。

    1.2  pGEX?4T?1 /Snail原核表达载体的克隆

    从人血管内皮细胞提取总RNA，在逆转录酶作用下，合成cDNA。以逆转录的cDNA为模板，用上游引物5′?CTGCAGGACTCTAATCCAG?3′（含有EcoR I内切酶位点）和下游引物5′?ATCCTTGGCCTCAGAGAGC?3′（含有Sal I内切酶位点），进行PCR扩增，得到Snail C?末端377bp的DNA片断；酶切、琼脂糖凝胶电泳分离后，用玻璃奶法（自制）纯化回收，与pGEX?4T?1原核表达载体定向连接。转化DH5α感受态细菌，提取质粒并酶切鉴定重组体。

    1.3  融合蛋白的诱导表达与纯化

    1.3.1  表达鉴定  表达质粒Snail/ pGEX?4T?1转化大肠杆菌DH5α后，经过酶切鉴定，挑取阳性细菌克隆至3ml LB/Amp+试管中培养3～5h。SDS?PAGE分析融合蛋白的诱导表达情况。

    1.3.2  可溶性鉴定  离心诱导菌液，收集菌体，以PBS重悬（50μlPBS/1ml菌液），加细菌裂解液混匀，冰浴。加入Triton X?100至终浓度为1%，冰浴。冰上以20Hz间歇超声裂解。再离心并分别收集上清和沉淀，进行SDS?PAGE，证实融合蛋白以包涵体形式存在。

    1.3.3  纯化  加5倍体积超声缓冲液悬浮沉淀，冰上间歇超声30s，离心弃上清。重复3～4次。沉淀加等体积SDS?PAGE loading buffer，超声重悬，沸水煮5min后上样，100V电泳6～7h。用冷0.1MKCl浸泡胶，切下目的条带放入透析袋内。将透析袋置于水平电泳洗脱装置内，60V洗脱过夜，次日100V继续洗脱1h，然后反转电极向相反方向洗脱3～5min。吸出透析带内液体，蔗糖包埋浓缩，PBS透析。行SDS?PAGE定量，即获得纯化的融合蛋白。

    1.4  抗Snail多克隆抗体的制备  抗原为原核表达并经SDS?PAGE胶纯化的GST/Snail融合蛋白，免疫新西兰白兔。取耳血，用ELISA法测定抗体效价，当效价达到10-5时，放血，收集血清。

    1.5  抗体效价和特异性免疫学鉴定

    1.5.1  酶联免疫吸附实验（ELISA）检测抗体滴度：观察结果并用ELISA Reader测OD490nm。

    1.5.2  Western Blot鉴定抗体  SDS?PAGE分析融合蛋白的诱导表达情况。

    2  结果

    2.1  Snail/ pGEX?4T?1原核表达载体的构建和鉴定结果  以Snail全长为模板，PCR大量扩增出Snail片段，经鉴定在约400bp处有条带扩出，与推算值相符；将目的片段装入 pGEX?4T?1原核表达载体后，酶切鉴定正确，在近400bp处有条带释放。

    2.2  融合蛋白GST/Snail的诱导表达和纯化  经纯化的GST/Snail融合蛋白只有一条蛋白带。

    2. 3  Snail多克隆抗体活性鉴定

    2.3.1  ELISA鉴定  经制备型SDS?PAGE进一步纯化的融合蛋白GST/Snail免疫新西兰兔获得抗血清，ELISA实验结果表明，其效价为5×105。

    2.3.2  Western Blot 鉴定抗体  Snail/ pGEX?4T?1感染的细胞在近40KD处出现条带。

    3  讨论

    本课题通过基因工程手段原核表达Snail羧基端的GST融合蛋白［3］，然后免疫新西兰兔获得效价高、特异性强的抗Snail抗体，与一些进口抗体相比造价低，且适用于免疫荧光、石蜡切片等［4］，为深入研究其功能和探讨其与肿瘤等疾病的相关性提供了工具。我们利用该抗体研究了宫颈不同组织学阶段的蜡块标本，Snail1表达的免疫组织化学反应在宫颈癌中呈上升趋势，阳性表达率为81.9%，与正常及非典型增生组差别明显（P＜0.05），证明Snail与癌分化程度相关。表明了Snail是肿瘤进展过程中浸润的一个重要的调节因素［5］，为今后进一步揭示肿瘤的浸润和转移开创了新的途径和工具。

【】
  ［1］ Cano A, Perez?Moreno MA，et al. The transcription factor snail controls epithelial?mesenchymal transitions by repressing E?cadherin expression［J］. Nat Cell Biol，2000，2(2):76?83.

［2］Comijn J, Berx G, Vermassen P. Mechanisms of inactivation of E?cadherin in breast carcinoma: modification of the two?hit hypothesis of tumor suppressor gene［J］. Mol Cell，2001，7(6):1267?1278.

［3］Bolos V, Peinado H, Perez?Moreno MA, et al. The transcription factor Slug represses E?cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors［J］. J Cell Sci，2003，116(Pt 3): 499?511.

［4］Comijn J, Berx G, Vermassen P. The two?handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E?cadherin and induces invasion［J］. Mol Cell，2001，7(6):1267?1278.

［5］Blanco MJ,Moreno?Buero G, et al.Correlation of Snail expression with histological grade and lymph node status in breast carcinomas［J］. Oncogene，2002，21(20): 3241?3246.