小发夹RNA介导的基因沉默及其应用

【关键词】  RNA干扰；shRNA；基因功能分析；基因
    发夹结构的RNA（hairpin RNA）是RNA二级结构中最简单的。它是由一条RNA单链自身折叠，形成双链的茎，再加上一条单链的环构成，因此，发夹结构RNA又称为茎?环结构RNA，在整个生物界中普遍存在。最近，一类特殊的发夹RNA?小发夹RNA显示参与了转录后基因表达的调控，这些shRNA在基因稳定沉默中起重要的作用。shRNA介导的RNA干扰技术已经成为研究哺乳动物细胞体内外基因功能强有力的工具。

    1  siRNA、stRNA、miRNA与RNAi

    RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，小干扰RNA (small interference RNA, siRNA)是RNAi过程中重要的中间分子，是一类长约21～23个核苷酸(nt)的特殊双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)分子，与所作用的靶mRNA序列具有同源性，RNAi主要是通过dsRNA被核酸酶切割成siRNA， 再由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子而实现。

    最近，在线虫和蠕虫中发现了lin?4和 let?7 RNA，这两种RNA均来自于72nt具有发夹结构的前体RNA，经加工形成22nt的RNA。lin?4和 let?7基因与发育的时序性有关，一旦突变，会引起异时序性的发育缺陷。因其与发育的时序有关，所以称它们为stRNAs(small temporal RNAs) ［1］。同时在不同的生物体中，也已发现90多种发夹结构RNA，可产生21～23nt RNA，但它们不象lin?4和 let?7 一样时序性表达，因此将它们统称为 miRNAs(micro?RNAs) ［2］。

    stRNA、miRNA、siRNA及RNAi有何关系呢？研究发现，Dicer酶将siRNA和stRNA联系起来，Dicer酶可催化长dsRNA分解成siRNA，同时还能将稳定发夹结构的前体RNA分解成21～23nt的stRNA。当用siRNA将Hela细胞中的Dicer消除时，会发生72nt未加工的let?7前体RNA的积累。同样，在蠕虫中去除Dicer酶，会引起发育的异时性，也会发生未加工的let?7和lin?4前体RNA的积累［1］。eIF2C/Argonaute家族是RNAi和stRNA的又一联系者。当蠕虫eIF2C/Argonaute家族中特异蛋白缺陷时，其发育呈异时性表型，同时未加工的lin?4和let?7前体RNA积累［3］。在植物体中，miRNA的作用机制与siRNA介导的mRNA降解相似。用免疫沉淀法发现两种与SMN复合体（survival of motor neurons complex）密切相关的蛋白GEMIN3和GEMIN4。miRNA和GEMIN3/4复合体包含了与Argonaute 同源的eIF2C和Dicer酶［4］。因此，这一研究进一步揭示了内源性发夹miRNA与RNAi的关系。

    2  shRNA介导的RNAi

    长发夹结构的RNA(500～1000nt)分析基因功能的技术在低等生物中已大获成功。在哺乳动物中，这种技术已在小鼠的胚胎干细胞中取得进展。然而，在不同的哺乳动物体细胞中，试图用如此长的发夹结构RNA以介导持续的基因沉默，目前尚未成功。可能是因为长发夹结构RNA活化了干扰素（IFN）相关途径，对基因表达缺乏特异性。为避免IFN反应，人们正在试图用短的dsRNA结构来沉默靶基因。研究发现，小于30 个nt的dsRNA能特异性抑制基因表达，而不会造成非特异性作用。在哺乳动物细胞中，shRNA可以长期甚至稳定的发挥RNAi的作用，而不引起非特异性反应。因此如何得到shRNA是维持长期RNAi作用的关键。已有研究者了基于DNA载体在体内表达shRNA的技术。采用事先在体外构建能够表达shRNA的载体，再转移到细胞内转录shRNA的策略。在所构建的siRNA表达载体中，由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成，是因为RNA聚合酶Ⅲ一方面在体内有较高的转录效率，另一方面有明确的起始和终止序列。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1～4个U，这样就限制了RNA的大小，不会引起干扰素的非特异作用。已有研究者应用聚合酶Ⅲ启动子鼠U6、人U6、H1RNA及Val?tRNA启动子成功构建了siRNA表达载体［5～8］。

    为找到决定发夹结构最佳效率的因素，有研究者观察了不同长度的茎和环构建的shRNA对RNAi效果的影响。结果发现，shRNA茎在18～29个核苷酸长度时，其RNAi的效果相当，无明显差异，但当超过29个核苷酸时，可能引起非特异性反应，而无RNAi作用［9］。而Paddison等［10］却认为，长一点的dsRNA（达到29nt）比短的dsRNA更富有沉默活性。Sui等［11］认为在shRNA茎结构中不论是5' 茎链，还是3' 茎链，只要有一条茎序列和靶mRNA完全互补，就可以发挥RNAi作用。Yu等［9］认为在shRNA环结构中从3～9个核苷酸长度都可以导致成功的靶基因沉默，当环结构更长时，可能导致RNAi作用失效。而Brummelkamp［5］设计针对同一基因的三种shRNA，分别由5、7、9个核苷酸组成的环，比较它们的RNAi效果却发现，有9个核苷酸环的shRNA沉默作用和siRNA的作用相当，有7个核苷酸环的shRNA沉默作用较9个的要差些，而有5个核苷酸环的shRNA几乎无沉默作用。另有研究者认为，shRNA介导的RNAi作用主要取决于靶序列，不同的基因之间以及同一个基因的不同靶序列之间，它们的基因沉默效果存在着很大的差异，这可能与靶mRNA的量、结构、转化效率以及细胞类型等多种因素有关［12］。到目前为止，决定发夹结构最佳效率的因素仍不清楚。

    3  shRNA介导的RNAi技术的应用

    3.1  基因功能的研究

    由于RNAi可以高效、高特异性地沉默特定基因，容易产生功能丧失或降低突变，因此它可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段或不同器官中有选择地进行，产生类似基因敲除的效应。而与siRNA介导的RNAi作用相比，shRNA介导的RNAi作用能更长期甚至稳定的抑制目的基因的表达，更适合于对目的基因功能进行长期研究。

    3.2  疾病的治疗

    RNAi可直接用于疾病相关基因的抑制，从而达到疾病治疗或预防的目的。在抗肿瘤治疗中，RNAi可用于抑制癌基因的表达；也可用于抑制基因扩增或抑制融合基因表达；还可用于抑制其他肿瘤发生发展相关基因（如血管内皮生长因子VEGF、多药耐药基因MDR等）的表达。已有很多学者利用shRNA介导的RNAi作用，获得了长期甚至稳定抑制目的基因的作用，作用时间明显长于siRNA介导的RNAi作用时间，一般至少超过一周，有些甚至可以维持数月［13?15］。

    在治疗病毒性疾病的研究中，通过设计针对病毒基因组RNA的shRNA或针对宿主细胞病毒受体的shRNA来抗病毒，目前针对乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、HIV?1、SARS等均取得了令人欣喜的体外病毒抑制作用，shRNA 已显示出了长期的抑制效果。Moore等［16］利用腺相关病毒为载体在体外发现转染针对HBV的shRNA后一周，HBV能被抑制90%，抑制作用在5个月后仍能检测到。Wilson等［17］用siRNA表达载体方法也可以使HCV病毒被抑制超过3周。

    还可利用RNAi确定新的疾病相关基因，尤其是建立高通量的RNAi功能分析方法可以为下一步的药物筛选提供更多的可能靶蛋白；并可以利用RNAi来确认许多疾病的发生发展机制，为其治疗提供依据。

    3.3  体内实验研究

    在哺乳动物中最好研究稳定RNAi作用的方法就是产生转基因动物。传统的基因敲除技术需要大量的时间和精力的投入，这就限制了它用于大规模的基因功能研究。由于shRNAs易于产生功能缺失的显性突变体，使得我们的基因功能研究变得相对容易。最初的成功研究是在生殖细胞，接着shRNA 介导的RNAi已成功用于转基因动物的大规模基因功能研究，最近的一项研究更充分显示了RNAi体内试验的灵活性，通过3种不同shRNA不同程度的降调造血干细胞中p53的水平，再将转染后的造血干细胞转入易患淋巴瘤的转基因小鼠体内，结果产生了由不同的p53水平所决定的不同表型，从良性的淋巴组织增生到恶性的淋巴瘤［18］。这充分说明通过shRNA的不同程度的基因沉默可以产生不同的表型，这为我们进行体内基因功能的研究提供了有力的工具。

    3.4  转运方式的改进

    然而不管是体外合成siRNA，还是基于载体的siRNA表达系统，由于缺少高效低毒的转运载体，其作用在很大程度上受到转染效率的限制。事实上只有某些细胞系才可被有效转染，而对于原代细胞来说，几乎是不可能的。病毒载体仍然是目前常用的在细胞与整体水平进行基因转移的有效工具。逆转录病毒载体(retroviral vector)和腺相关病毒载体(Adeno?associated virus  vector)能够在哺乳动物细胞系和原代细胞进行稳定有效的基因转移。慢病毒载体(lentiviral vector)有更广的宿主范围，它能够产生表达shRNA的高滴度慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA。用慢病毒载体构建的siRNA表达载体能在体外高效稳定地抑制HIV?1基因的表达。在单轮感染系统，shRNA引起的抗病毒效应可持续35天，在多轮感染系统，shRNA引起的抗病毒效应也至少可持续7天［19］。慢病毒作为shRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。

    4 

    shRNA介导的RNAi技术为基因功能及基因研究提供了一种新的可供选择的方法，特别是在病毒感染性疾病的长期治疗研究中。用病毒载体作为转运载体，为RNAi技术的更广泛运用提供了保障。基因组高通量序列分析的自动化，shRNA介导的RNAi技术也提供了一种相对便宜的自动分析基因缺失表型的方法，特别是在微阵列基础上的表型筛选研究中。我们相信，随着研究的进展，shRNA介导的RNAi技术必将为人类疾病的治疗作出重大贡献。

【】
  ［1］ Knight SW，Bass BL. A role for the Rnase III enzyme DCR?1 in RNA interference and germ line development in C. elegans ［J］. Science， 2001， 293(5538): 2269?2271.

［2］ Brennecke J, Hipfner DR, Stark A, et al. Bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotie gene hid in Drosophila ［J］. Cell, 2003, 113(1): 25?36.

［3］ Williams RW, Rubin GW. ARGONARTE1 is required for efficient RNA interference in Drosophila embryos ［J］. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99(10): 6889?6894.

［4］ Meister G, Buhler D, Pillai R, et al. A multiprotein complex mediates the ATP?dependent assembly of spliceosomal U snRNPs ［J］. Nat Cell Biol, 2001, 3(11): 945?949.

［5］ Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells ［J］. Science, 2002, 296(5567): 550?553.

［6］ Paddison PJ, Caudy AA, Bernstein E, et al. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence?specific silencing in mammalian cells ［J］. Genes Dev, 2002, 16(8): 948?958.

［7］ Yu JY, DeRuiter SL, Turner DL. RNA interference by expression of short?interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells ［J］. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99(9): 6047?6052.

［8］ Kawasaki H, Taira K. Short hairpin type of dsRNAs that are controlled by tRNA (Val) promoter significantly induce RNAi?mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells ［J］. Nucleic Acids Res, 2003, 31(2): 700?707.

［9］ Yu JY, Taylor J, DeRuiter SL, et al. Simultaneous inhibition of GSK3alpha and GSK3beta using hairpin siRNA exprssion vectors ［J］. Mol Ther, 2003, 7(2): 228?236.

［10］Paddison PJ, Caudy AA, Hannon GJ. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells ［J］. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99(3): 1443?1448.

［11］Sui G, Soohoo C, Affarel B, et al. A DNA vector?based RNAi technology to suppress gene exprssion in mammalian cells ［J］. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99(8): 5515?5520.

［12］Kapadia SB, Brideau?Andersen A, Chisari FV. Interference of hepatitis C virus RNA replication by short interfering RNAs ［J］. Proc Natl Acad Sci, 2003, 100(4): 2014?2018.

［13］Stege A, Priebsch A, Nieth C, et al. Stable and complete overcoming of MDR1/ P?glycoprotein?mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference ［J］. Cancer Gene Ther, 2004, 11(11): 699?706.

［14］Yin ZH, Ren CP, Li F，et al. Detection of RNA interference in nasopharyngeal carcinoma cell lines using reporter genes ［J］. Ai Zheng, 2005, 24(3): 371?375.

［15］Izeradjene K, Douglas L, Delaney A, et al. Casein kinase II (CK2) enhances death?inducing signaling complex (DISC) activity in TRAIL?induced apoptosis in human colon carcinoma cell lines ［J］. Oncogene, 2005, 24(12): 2050?2058.

［16］Moore MD, McGarvey MJ, Russell RA, et al. Stable inhibition of hepatitis B virus proteins by small interfering RNA expressed from viral vectors ［J］. J Gene Med, 2005, 7(7): 918?925.

［17］Wilson JA, Jayasena S, Khvorova A, et al. RNA interference blocks gene expression and RNA synthesis from hepatitis C replicons propagated in human liver cells ［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(5): 2783?2788.

［18］Hemann MT, Fridman JS, Zilfou JT, et al. An epi?allelic series of p53 hypomorphs created by stable RNAi produces distinct tumor phenotypes in vivo ［J］. Nat Genet, 2003, 33(3): 396?400.

［19］Nishitsuji H, Ikeda T, Miyoshi H, et al. Expression of small hairpin RNA by lentivirus?based vector confers efficient and stable gene?suppression of HIV?1 on human cells including primary non?dividing cells ［J］. Microbes Infect, 2004, 6(1): 76?85.