恶性肿瘤组织CD8+/CD28+ 细胞表达与细胞凋亡的相关性
作者：夏欣一，吴永明，潘连军，黄宇烽，周振英
【摘要】 目的 探讨恶性肿瘤组织中CD8+/CD28+细胞杀伤肿瘤细胞的机制。方法 用流式细胞术检测恶性肿瘤组织中CD8+/CD28+细胞表达率及细胞凋亡（APO）水平，并分析两者之间的关系。结果 恶性肿瘤组织的CD8+/CD28+细胞检出率为（6.86±4.19）%,显著低于正常对照组织（11.85±3.80）%（P<0.01）。恶性肿瘤组织APO检出率为（1.49±1.24）%，显著低于正常对照组织（4.34±3.28）%,（P<0.01）。在恶性肿瘤组织中，CD8+/CD28+细胞检出率和APO表达水平呈显著正相关（r=0.599 5,P<0.01）。结论 恶性肿瘤能引起组织中CD8+/CD28+细胞表达率和APO检出率显著下降，且二者检出率呈显著正相关。恶性肿瘤组织中CD8+/CD28+细胞杀伤肿瘤细胞的机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡密切相关。
【关键词】 流式细胞术 恶性肿瘤 T细胞 细胞凋亡
Correlation between CD8+/CD28+ Cell Expression and Apoptosis in Malignant Tumor Tissue of Patients with Malignant Tumor
Key words：Flow cytometry； Malignant tumor； T lymphocyte；Cell apoptosis
尽管机体有着多种抗肿瘤的免疫效应，肿瘤仍可以在体内发生、，而且随着肿瘤的进展，反过来抑制了机体的免疫功能。这提示免疫功能和肿瘤发生间的作用是相互的，一方面免疫功能能影响肿瘤的发展，另一方面肿瘤也能改变机体或组织的免疫功能状态，机体的免疫功能状态与肿瘤的发生、发展过程密切相关[1]。研究恶性肿瘤局部组织的免疫状态，探讨局部组织免疫细胞杀伤肿瘤细胞的机制，不仅可以全面了解肿瘤的生物学特性，而且也有助于在临床上选用适当的生物疗法防治肿瘤，为肿瘤的免疫提供理论依据。为此，我们应用流式细胞术（flow cytometry, FCM）检测了190例恶性肿瘤患者局部肿瘤组织中CD8+/CD28+ 细胞检出率和细胞凋亡（APO）水平，并分析其相关性，结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 病例选择 选择本院2004年5月～2005年6月住院手术并经病理证实的恶性肿瘤患者190例，包括乳腺癌115例、卵巢恶性肿瘤39例、宫颈癌23例、肝细胞癌13例。男性12例，女性178例；年龄27～76岁，中位年龄51.2岁。均为初诊患者，在手术前未进行化疗、放疗或生物治疗。选择手术后新鲜肿瘤组织作为检测样品；另外在乳腺癌患者中选择临床Ⅰ期患者14例，在其肿瘤手术切缘外10cm左右处取1小块乳腺组织作为正常对照。
1.2 方法
1.2.1 仪器、分析软件与试剂 流式细胞仪为FACSCalibur,美国BD公司产品，氩离子激光器功率为15 mW，激发光波长为488 nm。利用BD公司提供的CellQuest软件程序，每份样品均获取2×104 个细胞，并用该软件程序分析CD8+/CD28+ 细胞的表达率；另用Modifit3.0软件程序分析样品细胞的DNA含量, 进而分析APO水平。CD8?FITC/ CD28?PE双标记单克隆抗体试剂购自苏州苏医生物基因技术有限公司。溶红细胞液为本实验室自行配制。
1.2.2 样品制备与染色方法 取新鲜组织1小块，用筛网法制成单细胞悬液，使细胞浓度调整为1×106/ml，取100μl细胞悬液，加10μl CD8?FITC/ CD28?PE双标记单克隆抗体试剂，在室温暗处反应20min，然后加入溶红细胞液1.5ml，溶解红细胞10min后，用pH7.4，0.01mol/L的 PBS缓冲液洗涤1次，再加0.5ml PBS液稀释混匀。然后上流式细胞仪检测分析CD8+/CD28+细胞的检出率。 恶性肿瘤组织细胞的DNA含量检测，采用FCM?DNA检测分析常规方法[2]。在DNA直方图上，在二倍体细胞G1期细胞峰前的亚二倍体细胞峰为APO峰，以其细胞数占分析细胞的百分比作为APO水平。
1.3 统计学分析
计量资料采用t检验，恶性肿瘤组织CD8+/CD28+细胞检出率与APO水平行直线相关回归分析。P<0.05为差异有显著性。所有数据分析均采用SPSS11.0统计软件完成。
2 结果
2.1 恶性肿瘤组织的CD8+/CD28+ 细胞检出率和APO水平
恶性肿瘤组织的CD8+/CD28+ 细胞检出率和APO水平均显著低于正常对照组织（P<0.01），见表1。表1 恶性肿瘤组织CD8+/CD28+
细胞检出率和APO水平（%）
组别nCD8+/CD28+±sPAPO±sP恶性肿瘤1906.09±4.191.49±1.24<0.01<0.01正常对照1411.85±3.804.34±3.28
2.2 恶性肿瘤组织CD8+/CD28+细胞和APO水平的相关性分析
对190例恶性肿瘤患者的CD8+/CD28+细胞检出率和APO表达水平进行相关和回归分析，其相关系数为r=0.5995,a=0.4908,b=0.2329,拟合的回归方程式为Y=0.4909+0.2329X。结果显示，恶性肿瘤组织CD8+/CD28+细胞检出率和APO表达水平呈显著正相关（P<0.01）。
3 讨论
3.1 恶性肿瘤组织CD8+/CD28+细胞表达和APO水平的特征
CD8抗原是双硫键二聚体，每个单体的相对分子质量约为32 000～34 000。 CD8分子表达于细胞毒或抑制性T细胞，是该T细胞亚群细胞表面的特异性标记。CD28抗原是含2条肽链的双硫键同构二聚体，每条肽链的相对分子质量为44 000。根据CD28抗原在CD8+细胞中表达的不同，把CD8+细胞分为两个细胞亚群—CD8+/CD28+细胞和CD8+/CD28? 细胞，即细胞毒T细胞（CTL）和抑制性T细胞。早在1863年Virchow等就发现肿瘤局部有炎性细胞浸润，以后逐渐认识到肿瘤局部的炎性细胞主要是淋巴细胞，这些淋巴细胞浸润可能表明了体内抗肿瘤的免疫反应；在1986年美国学者Rosenberg等就从肿瘤组织内分离到了肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltration lymphocyte,TIL)；进一步研究证实，TIL细胞中主要是T细胞，而在这些T细胞中又以细胞毒T细胞（CTL）为主。因此，肿瘤局部组织CTL的检测比外周血T细胞分析更能直接反映肿瘤?宿主的免疫应答状态[3]。本研究显示，恶性肿瘤组织中CD8+/CD28+细胞检出率显著低于正常对照组织。这表明肿瘤组织的免疫能力均有所下降，即其免疫应答反应可能受到肿瘤因素的抑制。
CTL被激活后是机体重要的抗肿瘤效应细胞，可直接杀伤带有致敏抗原肽?MHCⅠ分子的肿瘤细胞，它们对肿瘤细胞的识别和杀伤受MHC?Ⅰ抗原的限制，杀伤带有相同等位型MHC?Ⅰ类抗原的肿瘤细胞。CTL杀伤肿瘤细胞机制主要是CTL与肿瘤靶细胞结合形成效靶结合物，通过TCR与抗原肽?MHC复合物及粘附分子介导的信号传导过程，使CTL细胞脱颗粒。在Ca2+ 存在的条件下，CTL分泌的细胞毒颗粒??穿孔素和颗粒酶进入效靶细胞之间的微环境中，穿孔素聚合形成多聚穿孔素，插入靶细胞膜形成穿膜的管样结构，一方面使细胞膜通透性变化，Na+、水进入细胞内，K+及大分子（如蛋白质）从靶细胞内流出，改变靶细胞的渗透压，最终导致靶细胞溶解，另一方面是颗粒酶的协同作用，引起典型肿瘤靶细胞溶解[4]。这些都是CTL以使肿瘤细胞溶解坏死的方式杀伤肿瘤细胞。但目前有关CTL 以诱导肿瘤细胞凋亡的方式杀伤肿瘤细胞的报道还不多，尤其是得到临床资料证实的报告更少[4]。本文对190例恶性肿瘤患者肿瘤组织APO检测发现肿瘤组织APO表达水平显著低于正常对照组织，而且APO水平下降与CD8+/CD28+细胞检出率下降呈明显的正相关关系。这表明诱导肿瘤细胞凋亡可能是细胞毒T细胞杀伤肿瘤细胞的重要方式之一。有报道，CTL细胞膜上的Fas配体（Fas ligand,FasL）与肿瘤细胞上的Fas相互作用，是诱导靶细胞凋亡的主要途径之一。Fas具有传导细胞凋亡信号的作用，是一种细胞凋亡诱导受体。FasL是激活的T细胞所表达的一种跨膜糖蛋白,属于肿瘤坏死因子家族，相对分子质量为40 000。FasL?Fas相互作用，使Fas的细胞内死亡功能区交联，启动信号传导过程，最终导致肿瘤靶细胞凋亡[5]。
3.2 恶性肿瘤组织CD8+/CD28+细胞和APO 水平检测的临床意义
恶性肿瘤组织中CD8+/CD28+细胞和APO表达水平都是恶性肿瘤的生物学指标。近半个世纪以来，关于实体瘤中TIL（以CTL为主）的大量报道都一致认为TIL的浸润程度与肿瘤的预后呈正相关。如Lipponen等[6]认为，肿瘤组织内TIL含量多少，可作为评价肿瘤预后的独立指标。这提示TIL是具有一定免疫学意义的浸润，而不是简单地从血流中的渗出。还有文献报道，细胞凋亡不仅是反映肿瘤效果的指标，而且也是判断肿瘤恶性度及预后的生物学指标[7，8]。本文结果显示，恶性肿瘤组织中CD8+/CD28+ 细胞检出率与APO水平均显著降低，并有良好的正相关关系。如果用这两项生物学指标同时判断肿瘤的恶性程度和估计患者的预后，这将提高对肿瘤恶性程度判断及患者预后估计的准确性。另外，如果应用FCM把CTL从恶性肿瘤组织中分离出来，经IL?2体外培养激活后用于恶性肿瘤的治疗，CTL的抗肿瘤效果比LAK细胞要增强50～100倍。因此，CTL用于恶性肿瘤治疗，可以把肿瘤的免疫治疗研究推向更高的阶段[4,9]。
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