己糖激酶与恶性肿瘤关系的研究进展
【关键词】 己糖激酶 肿瘤 糖酵解
大多数正常组织在有氧时通过糖的有氧分解获取能量，只有在缺氧时才进行无氧糖酵解。肿瘤组织则即使在氧供充分的条件下也主要是以无氧糖酵解获取能量。这与瘤细胞线粒体的功能障碍，以及瘤细胞的酶谱变化，特别是糖酵解关键酶活性增加和同工酶谱的改变有关。己糖激酶(Hexokinase,HK)是糖酵解途径中的第一个酶,也是肿瘤组织中糖酵解的限速酶,它在肿瘤组织中表达的量及活性的增加,使得肿瘤组织在乏氧的情况下,仍能保证足够的能源,并且糖酵解的许多中间产物可以被瘤细胞所利用,用来合成蛋白质、核酸及脂类等，从而为瘤细胞本身的生长和增生提供了必需的物质基础。本文就己糖激酶的特性在肿瘤中的表达特点和机制,以及相关的进展作一综述。
1 己糖激酶在正常组织中的性质
己糖激酶是催化己糖使之磷酸化的酶，它是糖酵解途径的第一个酶,也是糖酵解途径的限速酶。在哺乳类动物的体内，一共有四种亚型的己糖激酶 (HKⅠ～Ⅳ)，它们各自有一定的组织特异性。Ⅰ型主要存在于脑组织中，Ⅱ型是胰岛素敏感型的，主要存在于脂肪及肌组织中。除上述几种组织外,Ⅰ、Ⅱ型在其他各种组织中亦有少量的表达。Ⅲ型在肝、肾和肠组织中有微量的表达。HKⅣ仅在肝和胰中存在，也就是我们所熟知的葡萄糖激酶，把它称作HKⅣ有一定的误解，因为它可使其他的己糖磷酸化。在某种具体的组织中, HK各型之间的配比也随着年龄的变化而变化。如在新生鼠的肝组织中, HKⅡ是占优势的,而在成年鼠的肝组织中,其含量却是微乎其微的; 而且在新生鼠的肝组织中,基本不表达HKⅣ,但随着年龄的增长,其含量会逐渐增多。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型分子量相似约为100 kDa，而Ⅳ型的分子量约为50 kDa。HKⅠ C端与N端的序列有30%的同源性，这也暗示HKⅠ、 ?Ⅱ、和?Ⅲ可能是由最初的50 kDa的己糖激酶片断复制、融合而成。
用ATP的同功异质体（8?azino?ATP）处理HKⅠ后,HKⅠ可以被限制性蛋白水解酶水解成48和52 kDa的两个片断，这说明了HKⅠ酶的活化位点在C端的那一半序列上。用葡萄糖的同功异质体标记HKⅠ可以得到同样的结果。但 Ardehali等 [1]实验证实: HKⅡ的N端及C端序列都各有一个催化位点,这一点与HKⅠ的单催化位点是不相同的。
2 己糖激酶与恶性肿瘤
2.1 己糖激酶在恶性肿瘤中的表达
70多年前Warburg就发现了肿瘤的高糖代谢的特点。肿瘤细胞中大约60％的ATP来源于糖酵解途径,在切除的肺、胃肠及乳腺恶性肿瘤的组织中已经证实其HK的含量是增高的,并且在乳腺癌中已经发现，当病灶发生转移时，HK的活性会更高。也有研究报道，肾肿瘤组织中HK的活性会增加，而且会发生相应亚型的变化[2]。
实验证实在四种HK的同工酶中, HK Ⅱ与肿瘤相关性最大。Sebastian和Kenkare[3]通过RT?PCR的方式发现很多肿瘤细胞系中都有HK Ⅱ RNA的诱发和过表达。HKⅠ RNA也有不同程度增加。至于HKⅣmRNA,只在肝和胰腺肿瘤中有发现,且亲和力低。
现已有很多关于肝癌组织中HK表达水平的研究，这些研究表明肝癌的同时伴有HKⅣ转化成HKⅠ和?Ⅱ[4]，并且其活性及其与线粒体结合(即己糖激酶的微粒形式)的比率都有增加。 在鼠肝癌的模型中发现,正常肝细胞中的HKⅣ会被另一种催化反应速度的HK所代替。这种新型的HK并没有在肿瘤的前期病变（透明细胞性、嗜碱细胞性、混合细胞性病灶）中出现，这一点说明它的基因转换只在混合细胞病灶/癌变阶段出现。HKⅡ可以由疏水作用色谱分成两种亚型(HKⅡa and ?Ⅱb)，它们的比率可随转化阶段的不同而改变，在分化好的瘤细胞中HKⅡa会更高一些。在苯基—琼脂糖凝胶上可通过疏水作用色谱将Morris肝癌细胞中的HKⅡ分成两种亚型。HKⅡb在胞浆和与线粒体结合的形式(即微粒型)中都是占绝对优势的，不过Ⅱb∶Ⅱa的比率在微粒形式中(6～8)要高于胞浆中(1.5～2)。HKⅡa 和 HKⅡb的分子量都是110千道尔顿，但是它们的酶催化反应速度常数以及在G6p和1,6?二磷酸葡萄糖作用下的抑制常数是不一样的。利用Northern blot的方法可以发现HKⅡ有两种不同的mRNA转录子，这也说明HKⅡa and –Ⅱb是起源于不同的RNA转录和/或处理。
2.2 恶性肿瘤中, HK与线粒体结合的特点
正常组织中, 游离型的HK是占绝对优势的(脑组织中除外，其微粒型的HKⅠ占70%以上)。而在肿瘤组织中,微粒型HK的比率明显增加。
有实验结果显示[5],在通常情况下，线粒体结合的HK会优先使用线粒体所产生的ATP。但是当线粒体外产生的ATP（糖酵解）超过线粒体内时（氧化磷酸化），与线粒体结合的HK会使用线粒体外产生的ATP。这些结果表明微粒型的HK是糖酵解和氧化磷酸化之间的一个桥梁。HKⅠ和?Ⅱ可以通过N端尾部的15个疏水的氨基酸与线粒体结合, 但是HKⅢ 和?Ⅳ则不能。 恶性肿瘤细胞相对于正常细胞而言，其线粒体具有更高的HK结合能力。有实验对比了肝的良恶性细胞之间, HK与线粒体结合位点的差异[6]。 试验结果表明恶性肿瘤细胞株AH130中的三种孔蛋白(VDAC1、VDAC2和VDAC3)，比正常细胞的转录水平要高的多。说明这种结合能力的差异, 并不是由于结合位点结构的不同导致的，而是由于结合位点数量的差异造成的。
有关与线粒体结合的HK的另一个进展是，它可以促进蛋白的合成，这一点在增生活跃的细胞中更明显[7]。因为与线粒体结合的HK除了能更有效的利用ADP外，它也会产生ATP来促进三羧酸循环，由此可以使三羧酸循环中的一些中间产物比如谷氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸等增多。而且，与线粒体结合的HK可以保护细胞免于调亡/死亡[8]，有研究表明，Akt(丝/苏氨酸激酶)可以促进HK与线粒体的结合[9]。两者在致癌方面有协同作用。
尽管现在普遍认为HK的微粒形式是源于它与线粒体的结合，但也有少数人认为是HK与微球蛋白相结合的结果。相关的争论仍在继续。
3 恶性肿瘤中己糖激酶表达增高的机制
HK尤其是HK Ⅱ对于快速生长的肿瘤的代谢行为来说是至关重要的。HKⅡ表达的增多， 从基因水平上而言，首先是其基因复制的增多。 Rempel等[10]在鼠肝癌细胞系AS－30D中证实HKⅡ基因的拷贝数比正常的鼠肝细胞增加5～10倍。限制片断长度多态性分析表明HKⅡ 基因并没有重排，这也就说明基因数量的增多是建立在原基因稳定扩增的基础上的。
就基因水平,另一个重要的原因就是HKⅡ的启动子有广泛的信号转导级联激活途径。AS?30D中HKⅡ启动子可以被胰岛素，乏氧环境及佛波酯所激活，这也说明肿瘤中HKⅡ启动子的信号转导级联途径是比较混乱的[11]。HKⅡ的启动子也可由突变型的p53反式激活。 p53亦可以通过突变而减弱对细胞周期的控制，因此而进一步促进HK基因的转录。ＨＫ Ⅱ的基因启动子附近的一个狭小区域中富含各种反应元件,它们可以分别和Sp1、Sp2、Sp3、CREB及 NFY等蛋白结合,使启动子活化。这段序列对于肿瘤中HKⅡ的过表达有着重要的意义[12]。 另有一些实验表明缺氧诱导因子1α(HIF?1 alpha) 与HKⅡ的水平是密切相关的[13]。 在肝癌细胞ＨＫⅡ的基因启动子的远端有两个可结合缺氧诱导因子的区域,且在缺氧的环境下, ＨＫⅡ启动子的活性可增加到三倍。
另外,最近也有表明HKⅡ在肿瘤中的表达,与其基因甲基化程度有关, 即甲基化程度越高越不利于HKⅡ的表达[14] 。
在蛋白水平，发现HK活性的增强同HK与线粒体的结合水平有关。肿瘤中大多数的HK是与线粒体的孔蛋白相结合的，由此它可以优先利用线粒体产生的ATP。Mg2+和Pi可以阻碍G6P对HK的溶解作用，碱性的增加则可提高HK与线粒体的结合，如将胶质瘤细胞内的pH值从6提高到8，发现微粒型的HK片断从61%提高到81%。
4 有关己糖激酶在肿瘤方面的进展
肿瘤特征性的糖代谢,使得这些糖代谢的酶类,就像肿瘤中其他的生物行为的调节因子一样，最近也引起了人们的关注。从理论上而言，一定程度的抑制或影响这类调节因子，可以影响肿瘤的能量代谢，而正常细胞不受影响。
很早以前就知道氯尼达明可以通过抑制HK和线粒体结合,来促进肿瘤细胞调亡。而2?去氧葡糖以及3?溴化丙酮酸(3?bromopyruvate),作为HK的抑制剂,在早期的动物试验中已经有了可喜的结果[15,16]。在兔VX2的肝癌模型中，发现 VX2肿瘤植入兔子的肝脏组织后，有很高的HK表型。而且2?去氧葡糖以及3? 溴丙酮酸能最大程度的抑制其糖酵解水平。前者主要是抑制那些被HK 磷酸化产物的进一步代谢。而后者可以直接耗竭HK的储备,从而影响肿瘤的代谢。在体外的肝癌细胞系中，也可以证实，两者皆可促进细胞的死亡。
HK是唯一的一种和线粒体结合的酵解酶，锂可以使HK从线粒体上分离出来，从而抑制B16黑色素瘤细胞的增生，亦为药物治疗提供了新的方向[17]。
体外研究发现神经生长因子可以抑制神经胶质瘤的增生，有关它的评定指标如HK和葡萄糖?6?磷酸脱氢酶，也明显降低。推测这两者是通过糖酵解和戊糖磷酸路径来影响核酸的合成,从而抑制肿瘤生长的[18]。
有关肿瘤中己糖激酶的特点和机制,前人已经做了大量的工作,但其详细的分子生物学机制及潜在的临床应用价值仍需进一步的探索。 尽管如此,现有的资料已充分表明,它为肿瘤的治疗提供了契机,很可能成为当今肿瘤研究的一个新热点。
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