天参益智方对老年性痴呆模型大鼠神经细胞凋亡的抑制作用
【摘要】 目的研究天参益智方（TSYZ）对AD模型大鼠神经细胞凋亡的抑制作用和抗氧化作用。方法以慢性铝中毒法复制老年性痴呆模型大鼠，用TUNEL法观察模型大鼠海马和皮质内细胞凋亡水平，并检测脑线粒体超氧化物歧化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）含量。结果模型组大鼠海马和皮质具有典型的细胞凋亡特征，T-SOD活性降低，MDA含量升高；而天参益智方组海马和皮质神经细胞凋亡数减少，T-SOD活性升高，MDA含量降低(P<0.05或P<0.01)。结论 天参益智方具有明显抑制神经细胞凋亡作用和抗氧化作用，其改善AD大鼠学习记忆功能可能是通过多个环节整体治疗来实现的。
【关键词】 天参益智方 老年痴呆 细胞凋亡 超氧化物歧化酶 丙二醛
Abstract：ObjectiveTo study the effect of TSYZ formula on neuronal apoptosis and anti-oxidation of aged dementia model mice. MethodsThe aged dementia models were induced by long-term i.g AlCl3 . TUNEL was used to detect neuronal apoptosis,and cerebral SOD and MDA were studied.ResultsTypical apoptosis characters were markedly caused in model group, meanwhile the abilities of SOD decreased and the quantities of MDA increased remarkably.The TSYZ formula groups obviously inhibited neuronal apoptosis, increased the activity of SOD and lowered the quantities of MDA (P<0.05 or P<0.01). ConclusionIt is suggested that the inhibitory effects of TSYZ formula on neuronal apoptosis and anti-oxidation are remarkable. The machanisms maybe that the protective effects of TSYZ formula on the ability of learning and memory of AD model mice.
Key words：TSYZ formula; Aged dementia; Neuronal apoptosis; SOD； MDA
老年性痴呆（Alzheimer's disease, 简称AD）是一种严重影响老年人身心键康的，以进行性智力减退为特征的中枢神经系统退行性疾病，这种病的典型症状是记忆损伤,随着病情恶化,会出现行为的紊乱和个性的变化。据统计, 在我国60 岁以上人口中AD 的患病率占5%, 约600 万［1］，随着我国人口老龄化，老年痴呆症患者将日益增多，且发病年龄有提前趋势，因而老年痴呆症将成为本世纪威胁人类健康最严重的疾病之一，同时也将给我们带来沉重的社会和负担。因此，寻找治疗老年性痴呆症的有效药物，已成为医药领域的研究热点之一。天参益智方具有补脾益气、补肾填精、养血安神、平肝熄风、活血化淤、豁痰开窍等功效，其成分主要有天麻、人参、石菖蒲等。在先前的实验中,我们发现天参益智方对AlCl3所致AD模型大鼠的学习记忆能力有明显的改善作用，且能阻止Aβ在海马和皮质中的合成和沉积，本实验进一步研究天参益智方对AD模型大鼠神经细胞凋亡的抑制作用及其抗氧化作用。
1 器材
1.1 药物天参益智方，棕褐色粉末，由本院分析教研室提供。
1.2 动物SD健康大鼠60只，体重（200±20）g，雌雄兼备，由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(黔)2002-0001。
1.3 仪器与试剂Biomias99图象分析系统（四川大学图象图形研究所产品）；EG1160石蜡包埋机(德国Leica公司生产)；RM2145轮转切片机(德国Leica公司生产)；HI1210摊片机(德国Leica公司生产)；721分光光度计（上海第三分析仪器厂）；XH-B漩涡混匀器（江苏康健医疗用品有限公司）；HH-2数显恒温水浴锅（金坛市富华仪器有限公司）；三氯化铝（AlCl3·6H2O）（分析纯，上海盛龙化工有限公司生产）；脑复康 (杭州民生药厂生产)；TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒、即用型SABC、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司产品）；SOD试剂盒、MDA试剂盒（南京建成生物工程有限公司产品）
2 方法
2.1 痴呆模型建立［2～4］，实验分组及药物治疗SD健康大鼠60只，随机分为正常对照组（n=10）和模型组（n=50）。模型组给AlCl3溶液，第1个月和第2个月按500 mg·kg-1·d-1灌胃，以后一直自由饮用1.6 g·L-1AlCl3溶液；正常对照组灌胃等容的蒸馏水，用水迷宫法检测其记忆改变情况。痴呆模型建立成功之后，模型组随机分为5组，每组10只，即脑复康组，天参益智方高、中、低剂量组和痴呆模型组，以上药量均配成0.6ml液体灌胃给药,连续3个月，正常对照组、痴呆模型组灌以等体积的蒸馏水。整个实验过程避免与铝制品接触。
2.2 标本制备水迷宫测试结束24 h后，大鼠断头取脑，用10%中性缓冲液福尔马林固定4 h以上，石蜡包埋作连续冠状切片，片厚5 μm。
2.3 神经细胞凋亡在海马和皮质的表达每个标本随机选取1张切片，切片常规脱蜡、脱水后，进行TUNEL染色：3 %H2O2 阻断10 min ,用蛋白酶K处理后加入地高辛标记的dUTP,在末端转移酶的作用下反应120 min,使之转移到凋亡细胞断裂的染色质3'-OH末端，再加亲和素过氧化酶SABC反应30 min,最后DAB显色。凋亡的细胞呈黄色，为阳性细胞［5，6］。每张切片随机选取5个视场，视场面积为443 268 μm2，每个视场选取5个阳性表达区域，在400×倍光学显微镜下，通过Biomias99图像分析系统，检测平均灰度值，并用鼠标点击法计数阳性表达细胞，检测大鼠海马和皮质内细胞凋亡水平。
2.4 脑系数及脑线粒体SOD活性和MDA含量的测定水迷宫测试结束24 h后，处死大鼠，于冰浴中迅速取出脑组织，并精确称取，分别采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD、硫代巴比妥酸（TBA）化学比色法测定MDA和考马斯亮兰法测定蛋白含量，具体按试剂盒说明操作。同时，按下列公式脑系数。
脑系数(%)=脑湿重/g体重kg×100%
2.5 数据统计数据处理采用±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析检验。
3 结果
3.1 天参益智方对老年性痴呆模型大鼠海马和皮质神经细胞凋亡的影响TUNEL法检测神经细胞结果表明：与正常组比较，模型对照组切片中神经细胞核内可见大量深染的棕黄色颗粒，即凋亡小体，平均灰度值明显减少，阳性细胞数增加（P<0.01），提示模型组神经细胞凋亡增加。与模型组比较，天参益智方组神经细胞染色较浅，细胞结构较好，平均灰度值均明显增高，阳性细胞数减少（P<0.01），提示天参益智方组神经细胞凋亡减少，对AlCl3引起的大鼠脑内神经细胞凋亡具有明显的抑制作用。结果见表1～2。
表1 TSYZ对老年性痴呆模型大鼠海马神经细胞凋亡的影响（略）
与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；n=10
表2 TSYZ对老年性痴呆模型大鼠皮质神经细胞凋亡的影响（略）
与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；n=10
3.2 天参益智方对老年性痴呆模型大鼠脑线粒体SOD活性及MDA含量的影响表3表明，模型对照组脑线粒体SOD活性降低，MDA含量增加（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较，天参益智方高、中剂量组SOD活性升高，MDA含量降低（P<0.05或P<0.01），提示天参益智方具有明显的抗氧化作用，改善自由基在体内的过量代谢。
表3 TSYZ对老年性痴呆模型大鼠脑线粒体SOD活性及MDA含量的影响（略）
与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；n=10
3.3 脑系数的测定表4显示，模型组脑指数较正常组显著降低，而天参益智方高、中剂量组脑系数显著增加（P<0.05 ），提示天参益智方有抗脑萎缩的作用。
表4 TSYZ对老年性痴呆模型大鼠脑系数的影响（略）
与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；n=10
4 讨论
老年性痴呆已经成为严重威胁人类健康和生存质量的重要因素。AD临床表现为痴呆综合症，其病理改变主要为脑萎缩、神经细胞和突触大量丢失，特征性的细胞内神经纤维缠结（neurofibrilary tangle,NFT）、细胞外老年斑（senile plaque,SP）和脑血管淀粉样变。病变区主要分布于海马、皮质和杏仁核等与学习记忆相关的关键部位。AD病因复杂，发病环节较多，目前认为与神经递质紊乱、基因突变、氧化应激和自由基损伤、神经细胞凋亡、免疫/炎症反应、β-淀粉样蛋白（Aβ）和tau蛋白异常磷酸化等有关［1］。目前防治老年性痴呆的药物研究主要是依据该药能否对其病理有对抗和阻止作用，或对其病理发展有改善和逆转作用。中医认为AD 的病机是本虚标实。本虚为肾精亏损、气血不足; 标实为痰浊阻窍、气滞血淤。西医AD 主要采用脑血管扩张药、脑代谢改善药及促智药, 只能治疗其精神症状，难以治愈其髓海不足与脑髓空虚导致的脑萎缩。祖国医学采用标本兼治法, 补肾益精, 健脾益气, 活血祛淤, 豁痰开窍,辨证施治［7］。中药是以复合成分的方式进入体内，通过多靶点、多途径、多层次的综合协调作用达到整体治疗AD的目的，有其独特的优势。
细胞凋亡(apoptosis)又称细胞程序性死亡(Programmed Cell Death,PCD)，是生命的基本特点之一,是一种积极的不引起细胞炎症的细胞死亡过程，与细胞增殖共同维持机体正常生长发育和内环境的稳定， 细胞增殖和凋亡的失控会导致许多疾病的发生。近年来的研究表明, 细胞凋亡参与了中枢神经系统的退行性病变［8，9］，临床尸检也发现AD 患者脑内存在大量凋亡神经元。神经元过度凋亡，致脑萎缩,神经细胞和突触丢失,最后导致脑功能和结构的破坏，对细胞凋亡的诱导和抑制已成为防治AD的一种重要模式。本实验研究表明，天参益智方组细胞染色较浅，细胞凋亡数显著低于模型组，说明天参益智方具有较好的抑制神经细胞凋亡和抗脑萎缩的作用，从而改善AD 模型大鼠的学习记忆功能。
众多的实验研究已表明，自由基学说在衰老机制和AD病因中越来越显示出重要性［10］，过多自由基的产生可引起不同程度的细胞毒性及瞬时的不可逆损伤。AD患者脑组织中脂质发生严重过氧化，自由基增加，引起细胞核和线粒体DNA损伤，导致脑细胞功能减退，不能有效地清除脂褐质（老年色素和老年斑）［11］。清除自由基，降低体内过氧化脂质对延缓衰老和防治痴呆具有重要的作用。在正常生理情况下，线粒体是体内自由基的主要来源之一，同时又具有有效的清除自由基的系统，SOD是线粒体主要防御物质之一，维持体内自由基的正常水平。但是随着衰老，SOD活性降低，抗氧化能力下降，不能有效清除自由基，结果导致细胞损伤。同时，线粒体是介导细胞凋亡的中心环节［5，12］，凋亡的许多关键都集中在线粒体，如：细胞色素C，Ca2+，和凋亡诱导因子（AIF）的释放，在细胞凋亡的诸多诱因中，体内代谢或外源性因素产生的自由基均被证实可诱导细胞凋亡，细胞凋亡可能是机体氧化和抗氧化失衡的结果之一。表3～4表明，天参益智方能提高脑线粒体SOD 活性, 降低脂质过氧化产物丙二醛含量, 减轻氧化应激，清除自由基, 抑制神经元凋亡，抗脑萎缩,本实验研究也为开发中药及其提取物从多环节防治AD提供了客观的理论依据。
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［1］ 彭 颖,李晓波,杨静玉,等.中药抗阿尔茨海默病的研究进展［J］.世界技术-中医药化，2005,17(5)：63.
［2］ Golloib LG.Behavioral changes in induced by aluminum in drinking water［J］.Dementia,1991,2(5):278.
［3］ 张魁华,赖世隆,王 奇，等. 补肾益智方对老年性痴呆模型动物空间探索学习记忆功能的改善作用［J］.中草药,2002,33(12)：1093.
［4］ Morris RG,Garrud P,Rawlins JN,et al. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions［J］.Nature,1982,297(5868):681.
［5］ 张鹏霞,朴金花,欧 芹,等.黄芪对老年小鼠脑线粒体Mn-SOD、MDA及脑细胞凋亡的影响的实验研究［J］.老年学杂志，2003,23(9)：596.
［6］ 王 真,李宗楷,李电东.老年大鼠大脑组织一氧化氮、一氧化氮合酶的变化及神经细胞凋亡研究［J］.中华老年医学杂志,2001,20(6)：407.
［7］ 朱庄庄,张祥义,冯 莉.老年痴呆症的中医药研究进展［J］.中国康复理论与实践,2002,8(6):379.
［8］ Carson DA,Ribeiro JM.Apoptosis and disease［J］.Lancet,1993,341(8855)：1251.
［9］ Loo DT,Copani A,Pike CJ,et al.Apoptosis is induced by β-amyloid in culturedCentral nervous system neurons［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90(17)：7951.
［10］ Koshland DE Jr.The molecule of the year［J］.Science.1992,258(5090)：1861.
［11］ 尹宗宁.中医药防治老年痴呆症的研究进展［J］.中国老年学杂志,2005,25(3)：354.
［12］ 赵云罡,徐建兴.线粒体活性氧和细胞凋亡［J］.生物化学与生物物理进展,2001,28(2)：168.
