联合检测血浆中GSH?PX、MDA及肿瘤蛋白对肺癌筛检的Bayes判别分析
作者：卢桥发,王启明,甄海宁,鲍敏,张焕景
【摘要】 目的 探讨血浆中GSH-PX、MDA、 p21、p53及HSP70蛋白实测值建立的Bayes模型对肺癌的筛检价值。方法 用DTNB法对48例肺癌、34例非肿瘤性肺病病例（简称对照组）血浆中GSH?PX活力进行测定；用TAB法测定其MDA的含量；采用Western 斑点印迹法测定血浆中p21、p53及HSP70蛋白水平,并用其实测值建立的Bayes模型。结果 肺癌组血浆中GSH?PX活力小于对照组， MDA高于对照组，具有显著性意义（P<0.05）；与对照组相比,肺癌组p21、p53及HSP70蛋白水平均增高，差异具有显著性意义（P<0.01）；Bayes模型的敏感性、特异性和准确率分别为83.33%,74.19%和93.33%。联合细胞学检测,其诊断的敏感性可提高至91.67%。结论 GSH?PX、MDA、p21、p53及HSP70蛋白联合检测建立的Bayes模型对肺癌筛检提供了一条新的方法，可补充细胞学的诊断价值。
【关键词】 GSH?PX；MDA；肿瘤蛋白；Bayes模型；肺癌
Bayes Model of GSH?PX,MDA and Oncogene Proteins and Its Possible Role in The Screening of Lung Cancer
Key words：GSH?PX;MDA; Oncogene protein;Bayes model; Lung cancer
肿瘤发生的两个阶段，即诱发阶段和促癌阶段, 均和活性氧、自由基有关。肺癌的发生是随时间而累积的多分子遗传学改变过程［1］，只要任何一种癌基因蛋白阳性，表明细胞已经有癌基因突变和/或抑癌基因缺失，即成为恶性细胞。ras基因是一常见癌基因，变异的p21蛋白（ras基因突变产物）可使细胞产生持续增殖；p53基因通过参与细胞周期负调控而调节细胞增殖与分化［2］。目前，越来越重视血清学标志物在肿瘤早期诊断中的应用［3］。为此，本文通过检测48例肺癌患者血浆中的谷光甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxide,GSH?PX）的活力，丙二醛（Malon dialdehyde,MDA）的含量，p21、p53及HSP70蛋白的水平，并建立Bayes判别方程，探讨其作为肺癌筛检的可能性。
1材料和方法
1.1对象 经病理和/或细胞学证实的人群肺癌患者48例，其中鳞癌23例，腺癌25例。48例肺癌进行了痰细胞学检查和/或纤支镜检查后留痰,其中痰细胞学检查阳性病例8例；经纤支镜检查后留痰细胞学阳性病例13例。脱落细胞阳性检出率为43.75%。以非肿瘤性肺病组（N=34）为对照，包括支气管炎，肺炎，肺结核，矽肺，支气管扩张等；两组年龄（肺癌组64.86±9.53岁，对照组62.62±9.12岁）、工龄（肺癌组31.93±8.17年，对照组31.84±7.00年）相当，具有可比性。
1.2方法
1.2.1样品收集检测对象清晨空腹抽取静脉血5mL，分离血浆， -70℃保存，临用前取出融化。
1.2.2GSH?PX及MDA的测定GSH?PX测定用DTNB法直接测定，其单位为活力单位，其定义为0.1mL血浆在37℃反应5min使反应液中谷光甘肽（GSH）降低1umol/mL为一个活力单位。MDA测定采用硫代巴比妥酸（TAB）比色法，单位为nmol/mL，所用试剂均由南京建成生物工程研究所提供。
1.2.3肿瘤蛋白的测定用Western 斑点印迹法测定血浆中p21、p53及HSP70蛋白水平。一抗分别为兔抗人p21（pan?ras）抗血浆（1∶1000，美国sigma公司产）、兔抗人p53抗血浆（1∶1000，美国sigma公司产)和兔抗人HSP70抗血浆（1∶1000，同济医学院职业医学研究所自制）。二抗为辣根素过氧化物酶（HRP）标记的兔抗人IgG(1∶300，武汉博士徳生物工程公司)。用CS-930型双波段色谱扫描仪（日本岛津）进行图像分析，用积分光密度值代表蛋白水平。
1.3统计学处理先用SAS6.12软件建立数据库，组间差异性比较用t检验，率的比较用χ2 检验，最后对分析指标进行Bayes分析。
2结果
2.1GSH?PX和MDA含量测定
由表1可知，肺癌组GSH-PX活力显著低于对照组；MDA显著高于对照组（P<0.05）。
2.2p21、p53及HSP70蛋白的表达水平表1 血浆中谷光甘肽活力和MDA的比较 表2 血浆中p21、p53及HSP70蛋白表达水平（积分光密度±s)） 由表2可知，与对照组相比，肺癌组p21、p53及HSP70蛋白表达水平均增高，差异具有显著性意义， P<0.05。
2.3GSH?PX、MDA、p21、p53及HSP70蛋白联合检测的Bayes判别分析将48例肺癌、34例非肿瘤性肺病病例的GSH?PX、MDA、p21、p53及HSP70测定值分别建立Bayes方程，进行Bayes判别分析。结果显示，肺癌Yc=-40.8340+0.8954x1+7.368x2+0.0591x3+0.0285x4+0.0302x5 ;非肿瘤性肺病 Yl=-31.0427+0.112x1+5.055x2+0.0481x3+0.0238x4+0.0228x5。x1，x2，x3，x4,x5分别代表GSH?PX、 MDA、HSP70、p21和p53的实测值。判别标准：Yc> Yl,将样本判入肺癌组；Yc< Yl,将样本判入非肿瘤性肺病组。该组函数回代样本，回代的敏感性、特异行和符合率分别为83.33%、74.19%和93.33%。
2.4Bayes判别分析和细胞学联合检测诊断价值的比较 由表3可见，判别分析与脱落细胞比较，敏感性增高有显著性意义，P<0.01如二者联合应用，则敏感性由脱落细胞的41.94%可提高到91.67%。表3 判别分析、细胞学及其联合检测诊断价值
3讨论
肺癌的早期诊断尚无切实有效的方法，也缺乏单一特异的诊断实验。因此，寻找具有较高敏感性和特异性，而且易于检测的肿瘤标志物是肺癌筛检和诊断的一个热点［4］。同时主张动态监测；多项指标交叉互补监测，以提高诊断阳性率［3］。检测多项肿瘤标志物指标判断结果时，如仅以某指标升高即判定为阳性则特异性差，而以多项指标或两项指标同时升高才判定为阳性又不能兼顾敏感性。解决此问题的理想方法是进行多指标判别分析。Bayes准则下的多类判别分析是一具有人工智能的疾病诊疗评估系统，对于一个待归类的新病例，其属于已知各类的概率，最后把其归到概率最大的类别中去。
自由基是化学致癌物的活性形式之一，它通过膜的脂过氧化导致细胞癌变。同时，机体内有很强的抗脂过氧化系统，如GSH-PX、超氧化岐化酶 (Supperoxide Dismutase，SOD)等，可降低细胞内的自由基和脂质过氧化物的含量，在一定程度上使机体免遭自由基的损害。MDA是机体内不饱和脂肪酸在自由基的作用下产生脂质过氧化的最终产物。因此，MDA和GSH-PX可反映脂质过氧化和抗氧化系统失衡状态，预测人群中患肺癌的高风险性。本调查表明，肺癌组机体内GSH-PX的水平低于对照组；MDA的含量高于对照组，其差异具有显著性意义（P<0.05）。肺癌组GSH-PX活性降低，可能是由于肺癌患者机体内自由基长期得不到及时清除，产生自由基蓄积的结果。细胞膜损伤若得不到及时修复，可导致化学致癌物或肿瘤的发生［5］。
近年来研究表明，癌基因的激活、抑癌基因的失活或突变、生长因子的调节异常在肿瘤的形成和发展中起重要作用［6］。目前已获得多种针对癌基因、抑癌基因蛋白的单克隆和多克隆抗体，并用于肺癌的诊断与监测。冯震博等［7］研究发现，p21蛋白的过度表达是肝癌发生的早期事件，与肝细胞癌变过程密切相关。p21通过细胞膜分泌细胞至外环境中，检测血浆中p21蛋白，可以对肺癌患者早期识别［8］。卢桥发等［9］对PAHs相关肺癌血浆中肿瘤蛋白进行研究，结果p21、p53及HSP70蛋白联合检测的敏感性为82.76%,细胞学阴性肺癌患者肿瘤蛋白阳性率为72.22% 。本文用Western Blot法检测了经过细胞学和/或病证实的48例肺癌患者血浆中p21、p53及HSP70蛋白表达水平，并以34例非肿瘤性肺病组为对照，结果肺癌组三种蛋白水平均高于对照组,见表2，差异具有显著性意义，P<0.01，再一次证明ras基因、p53基因及hsp70基因可能与肺癌的发病有关。
痰细胞学检查是传统的早期发现肺癌的重要手段。这种方法是建立在形态学基础上的判断，往往因标本中肿瘤细胞过少及脱落细胞取材不当，对早期无症状的X线隐性癌难以查获。本文建立了以GSH?PX、MDA、p21、p53及HSP70蛋白检测结果的Bayes方程，样本回代的敏感性、特异行和符合率分别为83.33%、74.19%和93.33%，具有较高的判别能力。细胞学检查特异性好，但敏感性不高。Bayes判别分析虽然在良性疾病患者中存在一定的假阳性，见表3，但敏感性提高较大，如联合细胞学和Bayes判别分析，阳性诊断率可提高至91.67%。可见，脱落细胞、Bayes判别分析判断结果可相互补充，提高阳性检出率和准确性，诊断价值进一步提高。
【】
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