肝癌患者PBMC中TH1/TH2类细胞因子mRNA表达

                作者：王华，张天一，朱昌来，张春辉，倪启超  

【摘要】  　　目的 探讨TH1类细胞因子IL?2、 IFN?γ及TH2类细胞因子IL?4mRNA在Ⅰ期和Ⅱ期肝癌患者外周血单个核细胞（PBMC）中的表达模式， 并观察IL?2、 IFN?γmRNA在手术前后的表达变化。方法 采用逆转录聚合酶链反应（RT?PCR）方法测定8例Ⅰ期和10例Ⅱ期原发性肝癌患者手术前后及15例健康人外周血中IL?2、 IFN?γ的表达， 并用凝胶图像分析系统进行图像分析。 结果 在18例肝癌患者中， IL?2、 IFN?γmRNA的表达率分别为16.7%、 5.6%， 低于IL?4的表达率88.9%（P<0.05）， 呈现明显的TH2偏移状态， 且IL?2、 IFN?γ的表达强度在0.10～0.11之间， 也远低于IL?4的0.21～0.22； 在8例Ⅰ期肝癌患者中， 术前有25.0% (2/8)表达IL?2mRNA， 12.5%(1/8)表达IFN?γ， 高于对照组的13.3%（2/15）、 5.6%（1/15）； 手术后两者的表达率分别是50.0%、 37.5%， 高于术前组； 术前组及正常对照组两种细胞因子mRNA表达强度（0.10～0.12）明显低于术后组的0.20～0.22(P<0.05)。 另外， 10例Ⅱ期患者手术前后术均无IFN?γmRNA的表达。结论 原发性肝癌患者PBMC中也出现典型的TH2漂移， 另外， Ⅰ期肝癌经手术后可能增加外周血TH1类细胞因子mRNA的表达强度。 但短期内对中晚期肝癌患者PBMC中的TH1类细胞因子mRNA的表达无明显影响。

【关键词】  肝细胞癌　TH1/TH2细胞因子；RT?PCR

　　Expression of  TH1/TH2 Cytokines mRNA of PBMC in Hepatocarcinoma Patients

　　Abstract：Objective   To explore the expression pattern of TH1 type cytokines IL?2、IFN?γmRNA   and   TH2 type cytokine IL?4 mRNAin peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of primary hepatic cancer(PHC) patients, and observe the different expression of  IL?2 and IFN?γmRNA before and after the tumor resection.Methods  The expression of IL?2 、IL?4 and IFN?γmRNA of 18 patients and 15 normal volunteers in PBMC was detected by RT?PCR method and the results were analyzed by gel image analysis system.Results  The expression of IL?2、IFN?γ mRNA  were  16.7% and  5.6%，which lower than that of IL?4(88.9%,P<0.05) in 18 patients and it shows the typical TH2 shift. The expression value of  IL?2、IFN?γ mRNA was between 0.10～0.11  lower than that of  IL?4. The expression of IL?2 and IFN?γmRNA were 25.0% and 12.5% with 8 patients of stage I before the operation ,which was higher than that of control group; but, it was lower than that of the postoperative group(50.0%、27.5%  respectively). The expression value of pre?operative group and normal  control group （0.10～0.11）was significantly lower than that of the postoperative group (0.20～0.22, P<0.05). Besides,10 cases of stage Ⅱpatients have no expression of  IFN?γ before and after the tumor excision.Conclusion  The typical shift of TH2 occurred in PBMCs of PHC patients. Besides, surgical treatment might increase gene expression of TH1 type cytokines in PBMC of PHC patients with early stage, but it may be has no obvious effect on patients with intermedium or end stage in short period.

　　Key words：Hepatocellular carcinoma;  TH1/TH2 cytokines;   RT?PCR

　　0  引言
   
　　原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。自从TH1、TH2的概念提出以来，肿瘤的TH1/TH2反应是近年来国内外研究的热点，我们用RT?PCR法，检测18例I期和Ⅱ期原发性肝癌患者手术前IL?2、IFN?γ及IL?4 mRNA表达并探讨手术治疗对IL?2、IFN?γmRNA的表达的影响。 

　　1  资料与方法

　　1.1  临床资料  18例原发性肝癌患者，其中Ⅰ期8例，Ⅱ期10例，均系南通大学附属普外科2003年11月～2004年2月确诊的住院病人。分别于手术前后一周各抽取外周血4ml。术前均未接受放疗、化疗及免疫治疗。其中男11例，女7例，年龄40～75岁，中位年龄50.2岁；健康对照组中男10例，女5例，中位年龄48.5岁。

　　1.２  主要仪器与试剂  PCR扩增仪（美国MJ公司PTC?100型扩增仪），凝胶图像分析系统(上海复旦四星高科技术公司); Trizol（Sangon），逆转录酶M?MLV试剂盒（GIBCO）, Taq DNA聚合酶(Sangon)，各细胞因子引物由Sangon公司合成。

　　1.3  方法

　　1.3.1  总RNA制备及逆转录反应  见[1]。

　　1.3.2  PCR反应  在50μl反应体系中，加入10×PCR缓冲液５μl，25mM MgCL2 5μl, 10mM dNTPS4μl上下游混合引物2μl，Taq酶0.4μl，cDNA4μl,灭菌双蒸水29.6μl，充分混合，适当离心。反应条件：94℃ 3min, 94℃30s, 51℃30s, 72℃45s,共32个循环，再于72℃延伸8min。同时以β?actin作内参照，扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，四星凝胶图像分析系统拍摄。（见图1，2）

　　表1  ＰＣＲ引物β?actin 、IL?2及IFN?γ的引物序列（略）

　　1.3.3  ＲＴ?ＰＣＲ凝胶图像分析  以β?actin为内参照，应用ScnImage 图像分析软件进行表达强度分析。结果的判断以同时扩增的β?actin表达强度为基准，各细胞因子的相对表达强度（灰度值）按下列公式：表达强度（相对强度 relative value, RV）＝（背景灰度值－细胞因子灰度值）/（背景灰度值-β?actin灰度值）。

　　1.3.4  统计学处理  组间率的比较采用Fisher确切概率法

　　2  结果

　　2.1  在肝癌、正常对照组中， IFN?γmRNA的阳性表达率分别为5.6%、6.7%(1/15)；IL?2 为16.7%、13.3%，表现为TH1类细胞因子低表达状态；IL?4mRNA在肝癌患者、对照组中的表达率分别为88.9%(16/18)、6.7%(1/15)，两者有显著性差异，表现出明显的强势表达。

　　表2  肝癌组与对照组中三种细胞因子的表达（略）

　　2.2  正常人PBMC及原发性肝癌患者PBMC中几种细胞因子mRNA的表达强度分析  可见在对照组及肝癌组中IFN?γ、IL?2 mRNA的表达强度都在0.10～0.12之间，表达较弱；而在肝癌组中的IL?4 mRNA的表达强度明显增高，有显著性差异，见表3。

　　表3  肝癌组与对照组中三种细胞因子的表达强度（略）
   
　　*P<0.05,与对照组比较

　　2.3  术前及术后不同分期肝癌患者PBMC中IL?2、IFN?γ mRNA的表达差异  可见随病程，两种TH1类细胞因子mRNA的表达呈下降趋势，手术对Ⅱ期肝癌患者PBMC中IL?2 、IFN?γmRNA表达无明显改善，但可以提高Ⅰ期患者PBMC中IL?2，IFN?γ两种细胞因子mRNA的表达水平，见表4。

　　表4  不同分期手术前后IL?2 、IFN?γmRNA的表达（略）

　　2.4  肝癌患者术前组、正常对照组和术后组的２种细胞因子的表达强度分析，术前组、对照组IL?2、IFN?γmRNA的表达强度大多在0.11～0.12之间，而术后组的两种细胞因子的表达强度在0.20～0.22之间，明显高于另外二组，见表5。

　　表5  手术前后及对照组中IL?2 、IFN?γ的表达强度（略）

　　*P<0.05  与术前及对照组相比

　　2.5  PCR扩增产物电泳图（1.5%琼脂糖凝胶电泳）

　　图1  对照组IL?2、IFN?γ、IL?4   mRNA的PCR电泳图（略）

　　注：1.IL?2  2.IFN?γ  3.IL?4  4.100bpDNA Make

　　图2  手术前后Ⅰ期患者IL?2、IFN?γ    mRNA表达的PCR电泳图（略）

　　注：1. 100bp DNA Maker  2. IL?2(术前)  3． IL?2（术后）   4. IFN?γ（术前）  5．IFN?γ（术后）

　　3  讨论
   
　　T细胞介导细胞免疫是宿主抗肿瘤免疫的主要形式，辅助性T细胞可以分为TH1和TH2 两个功能亚群，其中TH1细胞主要分泌IL?2 、IFN?γ和TNF?α、β等细胞因子，主要介导细胞免疫，TH2细胞主要分泌IL?4、IL?10和IL?13 等细胞因子，主要介导体液免疫，TH1、TH2都由其共同前身TH0细胞分化而来。正常情况下，机体内两类细胞因子处于平衡状态并互相抑制，但在一定情况下又可互相转化。当TH1类细胞因子向TH2类细胞因子发生漂移时机体的细胞免疫功能将受到抑制，甚至导致肿瘤的发生。Yamamura等最先发现肿瘤患者以TH2型细胞占优势状态。随后，研究发现在非小细胞肺癌、绒癌、脑胶质瘤、胃癌、结肠癌、淋巴瘤等多类肿瘤中发生TH2漂移[2]。
   
　　IL?2 、IFN?γ是最重要的TH1类细胞因子，很多研究表明，在恶性肿瘤患者体内及肿瘤组织内呈低水平表达状态[3，4]。但目前中多报道肿瘤组织及瘤旁组织局部的两类细胞因子表达模式，而在早期及进展期肝癌患者手术前后外周血中的两种细胞因子基因表达变化则鲜有报道。
   
　　我们用RT?PCR的方法研究了18例原发性肝癌患者PBMC中TH1/TH2的表达模式，并观察手术对TH1类细胞因子IL?2、IFN?γmRNA的表达影响。患者IL?2与IFN?γ的表达与对照组并没有明显的差异，但肝癌患者中IL?4的mRNA的表达率和表达强度都明显高于对照组（P<0.01），说明肝癌患者外周血中也呈现出TH2的强势表达，抗肿瘤处于抑制状态。在对不同分期肿瘤患者研究时发现，在Ⅰ期原发性肝癌患者中，TH1类细胞因子IL?2与IFN?γmRNA的表达水平要高于Ⅱ期患者，也高于对照组，但IL?4 mRNA的水平低于Ⅱ期患者。提示在肝癌的早期阶段TH1类细胞因子发挥了肿瘤免疫功能；但随肿瘤，机体的TH1/TH2平衡紊乱呈现典型的TH2漂移，机体的抗肿瘤免疫功能受到抑制，这与曹志林等[5]的研究结果相同。在肿瘤切除一周后，IL?2、IFN?γmRNA的表达率呈现出增高趋势，分别达到27.8%、16.7%，提示手术可能能够增加早期肝癌患者PBMC中IL?2 、IFN?γmRNA的表达水平。
   
　　手术治疗能够明显增加Ⅰ期肝癌患者PBMC中IL?2 、IFN?γmRNA的表达率水平和表达强度，说明肝癌早期手术对改善患者体内的免疫功能也有着重要的作用，其机制可能与切除肿瘤组织后阻断或减少体内的免疫抑制因子有关[6]，使得机体的免疫功能有所恢复；而对于进展期肝癌，患者可能存在多中心病灶，手术很难清除体内所有的癌细胞，因而体内的免疫抑制在短期内不能得到完全的纠正，也有报道在Ⅱ期及Ⅲ期肝癌经手术切除2个月后外周血IL?2 、IFN?γmRNA的表达也能较术前增高[7]。因此，肝癌患者通过及早的手术治疗并联合主动免疫疗法对机体免疫功能的改善、提高肿瘤的手术疗效及促进术后肝功能的恢复可能都有十分重要的作用。
   
　　研究发现，10例Ⅱ期患者中，只有1例表达IL?2mRNA，手术后也仅此1例表达，且术前术后均未见有IFN?γmRNA的表达，提示随病程的发展，此两种细胞因子mRNA在PBMC中的表达可能有下降趋势，曹志新等的研究也表明，在Ⅰ期肝癌PBMC中这两种细胞因子在蛋白水平上的含量较Ⅱ期及Ⅲ期更高[5]。IFN?γ和IL?2是具有多种重要活性功能的细胞因子，机体要处于良好的抗肿瘤免疫状态与这两种细胞因子表达密切相关。IL?2 、IFN?γ在Ⅱ期肝癌患者体内的低表达水平可能是体内处于TH2的漂移而导致抗肿瘤免疫的抑制状态，也提示这种细胞免疫抑制现象会随病程的发展而更加严重，从而导致肿瘤细胞能够处于免疫逃逸状态，使机体无法组织起有效的抗肿瘤免疫反应。已有的研究表明，通过主动免疫方式体内再激活TH1可以逆转TH2漂移，提高抗肿瘤效应，并且逆转后的肿瘤细胞对抗癌效应细胞的反应明显增强[8]。也有研究表明[9]，在和其他消化系统器官的手术切除术相比，行肝切除术中的手术应激也能诱导体内明显短期的TH2反应和显著的高代谢状态。因此，在行肝癌的手术治疗过程中，应该考虑由此带来患者机体免疫状态的变化。
   
　　众多的研究结果表明，体内的TH2漂移将对抗机体的抗肿瘤免疫，并能保护肿瘤细胞发生免疫逃逸及抑制TH1类细胞因子的产生。我们的研究也证实在肝癌患者的PBMC中也有TH2漂移，并且这种TH1/TH2紊乱状态会随着肿瘤病程的发展而加重。而早期肝癌患者通过及时的手术治疗可改善体内的免疫状态。这可能为原发性肝癌的治疗提供新的思路。

【文献】
  　　［1］ 周丽英，王凡，黄强，等，脑胶质瘤细胞优势表达TH2类细胞因子的研究[J].细胞与分子免疫学杂志，2001,17(4)362?363.

　　［2］ Kharkevith D, Diseito?DI, Balch GC, et al. Characterization of antologous tumor?specific T?helper 2 cells in tumor?infiltrating lymphocytes from a patient with metastatic melanoma[J]. Int J cancer,1994,58(3):317?323.

　　［3］ Ren Z, Pang G, Clancy R, et al. Shift of the gastric T?cell response in gastric carcinoma[J]. J Gastroenterol Hepatol,2001,16(2):142?148.

　　［4］ 张筱茵，陈咏仪，等.胃癌局部细胞因子表达普分析[J].中华肿瘤杂志，2002,24(1):14?16.

　　［5］ 曹志新，陈孝平,吴在德,等.肝癌合并肝硬化患者脾脏TH1/TH2细胞因子免疫状态的研究[J].中华实验外科杂志,2001,18(6):518?519.

　　［6］ 杨兰泽,高静，等.胃癌患者血请IL?6、IL?8、sIL?2R和TNF?α水平的检测分析[J].上海免疫学杂志，2003,(23)4:224?275.

　　［7］ Cao ZX, Chen XP, Wu ZD.Changes of immune function in patients with liver cirrhosis after splenectomy combined with resection of hepatocellular carcinoma [J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2003, 4(2):562?565.

　　［8］ Tagawa M. Cytokine therapy for cancer[J]. Curr Pharm.Des,2000,6(6):681?689.

　　［9］ Ishikawa M, Nishioka M, Hanaki N ,et,al. Hepatic resection induces a shift in the Th 1/2 balance toward Th2 and produces hypermetabolic and hyperhemodynamic states[J]. Hepatogastroenterology, 2004,51(59):1422?1427.