通痹液分子透入对实验性椎管内瘢痕羟脯氨酸含量的影响
【关键词】 通痹液；,,椎板切除术；,,硬膜外瘢痕增生；,,羟脯氨酸
摘要：目的通过动物实验观察和评价通痹液分子透入对硬膜外瘢痕羟脯氨酸含量的影响，并初步探讨其作用机理。方法45只大白兔切除L5椎板后造成1.2 cm×0.5 cm硬脊膜裸露区，随机分为3组：空白组（BC组）不作任何，对照组（SC组）滤纸浸透0.9%氯化钠注射液后，行低频脉冲治疗，实验组（TB组）滤纸浸透通痹液后，行低频脉冲治疗。术后3、5、8周进行瘢痕组织行羟脯氨酸含量测定。结果第3周各组羟脯氨酸含量差别无显著性差异（P>0.05），第5周BC组羟脯氨酸含量高于SC、TB组（P<0.05），第8周TB组羟脯氨酸含量低于BC、SC组（P<0.01）。SC、BC组3个时相羟脯氨酸含量呈显著增加趋势（P<0.05），TB组羟脯氨酸含量也呈增高趋势，第 8 周羟脯氨酸的含量与第 3 周比较有统计学意义（ P<0.05 ）。结论通痹液分子透入通过药物分子和低频电脉冲的综合作用，能减少瘢痕生成，抑制胶原纤维的形成。
关键词：通痹液； 椎板切除术； 硬膜外瘢痕增生； 羟脯氨酸
硬膜外瘢痕增生是引起腰椎手术失败综合征（failed back surgery syndrome，FBSS）的一个常见的重要原因。一般认为，血肿和炎性渗出［1，2］是导致硬膜外瘢痕增生的重要因素。以活血祛淤、利水通络立法，用经验方通痹液通过分子透入预防FBSS取得较好的临床效果［3］，为探讨其作用机理，建立实验性椎管内瘢痕形成模型，观察其对羟脯氨酸含量的影响。
1 材料
1.1 材料
1.1.1 动物的选择 普通级健康成年大耳白兔45只，体重2.5～3.0 kg，雄性。由湖南中医学院实验动物中心提供。
1.2 药物的制备通痹液 由桃仁、红花、丹参、防己、黄芪等10味中药组成，按等份加入多能提取罐中水提3次，然后低温减压浓缩至5%浓度。药液由湖南中医学院第一附属制剂室制备。
1.3 仪器与试剂DZYB型电脑骨质增生治疗仪（北京无线电仪器厂生产）；751型紫外可见光分光光度计（上海分析仪器厂）；分析天平（北京光学仪器厂）；羟脯氨酸测试盒（南京建成生物工程研究所一分所提供，批号20020509）。
2 方法
2.1 椎板缺损模型的制作将全部45只家兔，按孙康等［4］的方法制作成椎板缺损模型。以横突和棘突明显突出的L7椎为参照，确定L5棘突，以L5棘突为中心，剪除面积为4.0 cm×4.0 cm的兔毛，用质量分数25%乌拉坦，按1.0 g/kg剂量行兔耳缘静脉麻醉，将兔固定于手术台上，局部用络合碘消毒，铺无菌巾。以L5棘突为中心，取兔背部正中切口，长约3 cm，向两侧剥离竖脊肌，暴露并咬除L5棘突及椎板，造成1.2 cm×0.5 cm椎板缺损，切除其下的黄韧带，清除硬膜外脂肪，完全裸露硬脊膜，清除碎骨片，彻底止血，冲洗切口，逐层缝合切口，无菌纱布包扎。所有动物术后3 d内每天肌注青霉素钠盐2次，40万u/次，伤口换药1次，5 d后拆线。
2.2 动物的分组造模成功后，将45只家兔称重，按体重大小排序编号，查随机数目表将45只家兔随机分为空白对照组（blank control group, BC组）、低频电对照组（0.9%sodium chloride group, SC组）、实验组（TongBi solution group, TB组），每组15只。所有动物在同一条件下单笼喂养，笼上编号。
2.3 治疗方法
2.3.1 BC组 术后不作治疗。
2.3.2 SC组 低频脉冲治疗，2.0 cm×2.0 cm滤纸加0.9%氯化钠注射液2 ml，垫在切口两侧并置导入，在运动阈下进行治疗，造模后第3天开始，1次/d，25 min/次。
2.3.3 TB组 低频脉冲治疗，2.0 cm×2.0 cm滤纸加通痹液2 ml，垫在切口两侧并置导入，在运动阈下进行治疗，造模后第3天开始，1次/d，25 min/次。
2.4 观察方法
2.4.1 观察时相点的确定根据预实验观察结果及相关资料，于术后3，5，8周3个时相点对BC，SC，TB 3组进行分批处死，每时相点各组处死5只动物。
2.4.2 标本的采集与预制 空气栓塞法处死动物后，立即完整取出手术段脊椎，从侧方切开竖脊肌，取椎板切除部位硬脊膜后部的瘢痕组织，大小约为0.2 cm×0.2 cm×0.1 cm，漂洗后置于100℃恒温箱中烘干，称干重。作羟脯氨酸含量测定。
2.4.3 瘢痕组织羟脯氨酸含量测定 烘干后的瘢痕组织按干粉10 mg/ml比例加入6 mol/L盐酸，在105℃高温下水解10 h，使其成为游离氨基酸，吸取水解液0.1 ml，滴入酸酞指剂，并加入2 mol/L的氢氧化钠0.3 ml中和盐酸，取标本液按羟脯氨酸试剂盒方法进行测试。根据胶原纤维中羟脯氨酸的含量比例（13.4%）推算出胶原纤维的含量［5］。
2.5 统计方法 各时相点组间比较采用方差分析，不同时相点组内比较采用两因素方差分析。
3 结果
硬膜外瘢痕羟脯氨酸含量测定结果见表1。第3周，各组瘢痕组织刚刚形成，羟脯氨酸含量无显著性差异（P>0.05）；第5周，BC组羟脯氨酸含量高于SC组、TB组，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），SC组羟脯氨酸含量高于TB组，具有显著性差异（P<0.05）。说明低频脉冲和通痹液透入均可减少瘢痕形成量，中药透入效果更优；第8周，BC组羟脯氨酸含量明显高于SC组和TB组，具有显著性差异（P<0.01），SC组羟脯氨酸含量高于TB组，亦具有显著性差异（P<0.01），说明低频脉冲和通痹液透入均可明显减少瘢痕形成量，通痹液透入效果更优于低频脉冲。BC、SC组相邻时相羟脯氨酸含量呈显著增加趋势（P<0.05），TB组羟脯氨酸含量也呈增高趋势，但相邻时相间的差异无统计学意义（P>0.05），第8周羟脯氨酸的含量与第3周比较有统计学意义（P<0.05），说明瘢痕组织的增生是椎板切除术后的基本病理变化，通痹液透入可明显抑制瘢痕增生。
4 讨论
4.1 椎管内瘢痕粘连形成机理腰椎手术后机体的修复属于瘢痕修复。以血肿为中介，在各种因素影响下，因多种炎性介质、生长因子引发的修复细胞增殖及活性增强，胶原超常合成，沉积与降解减少，是椎管内瘢痕增生与粘连形成的病理基础。中医理论认为，腰椎术后，椎板缺损，筋肉受伤，脉络破损，血逸脉外，在椎板缺损区形成血肿，致使淤血停留。如血肿量少，淤血能及时消散，血脉畅通，当无大碍，如血肿量大，无力自行消散，则刺激经络，阻碍经气，引发腰腿疼痛。淤积日久，气不行水，而化湿生痰，痰淤互结，在硬膜外形成淤痰块，更加挤压刺激腰部经络，使腰腿疼痛麻木症状缠绵难愈。综上所述，淤血作为腰椎术后不可避免形成的病理产物，如不能及时消散，则化湿生水聚痰，形成难以消除的块，成为导致腰椎手术失败综合征的重要致病因素。防治方法，应活血化淤，治病求本，同时又需利水消肿，达到既病防变的目的。
表1 各组不同时相硬膜外胶原含量（略）
组间比较★P<0.05,与BC组比较，*P<0.05;与SC比较,△P<0.05，与BC组比较，△P<0.05;与BC组比较*P<0.05，与BC、SC比较●P<0.01;组内比较与前一时相比，▲P<0.05；n=5
4.2 通痹液组方依据通痹液由桃仁、红花、丹参、田七、土虫、大黄、乳香、伸筋草、防己、黄芪等10味中药组成。方中以活血祛淤之桃仁、红花为君药，利水消肿之防已、黄芪为臣药，佐以活血化淤之丹参、田七、土虫、大黄、乳香及舒筋活络之伸筋草，共奏活血祛淤、利水通络之功。药研究表明，桃仁可提高血小板中cAMP水平，抑制ADP诱导血小板聚集，抑制血液凝固及血栓形成；红花具有抗凝血，抗血小板聚集及纤溶，减少胶原蛋白生成的作用；大黄可抑制细胞膜Na+，K+ATP酶的活性，提高血浆渗透压，使组织内水分向血管内转移，使血液稀释、血容量增加，从而解除微循环障碍；丹参可抑制成纤维细胞胶原合成率和纤维连结素的产量，抑制成纤维细胞的增殖和生长。防己、黄芪、田七、土鳖虫能抑制血小板聚集。
4.3 通痹液分子透入对椎管内瘢痕羟脯氨酸含量影响的作用机理胶原蛋白是构成瘢痕组织胶原纤维的主要组成成分，其主要特征是在它的氨基酸成分中，羟脯氨酸占12%～14%。除弹性蛋白含有1%～2%羟脯氨酸外，这个氨基酸在其它动物组织蛋白质中是没有的，因此，可把羟脯氨酸作为判断胶原含量的特殊标志。低频脉冲电作用于人体，具有改善局部血液循环、减轻组织水肿、促进炎症产物的吸收，加强局部组织的营养和代谢等特点。并且电流能提高组织膜和组织膜的通透性，使药物分子由于药物浓度梯度的扩散作用，通过皮肤的组织间隙与细胞间隙较多地进入体内，形成药物分子堆。药物分子堆一方面刺激皮内的末梢神经，起到局部和远隔部位的作用，另一方面药物进入相应组织后，在局部发挥其独特的药理作用，电流和药物还可能对末梢感觉器产生刺激，引起轴突反射及节段反射作用。本实验结果显示分子透入能降低模型动物硬膜外瘢痕组织中羟脯氨酸的含量。其可能的作用机制是：药物分子由低频电的作用，累积于病损处形成药物分子堆，电流和药物协同作用，降低局部炎症反应程度，抑制成纤维细胞的增殖和生长，减少胶原纤维形成。
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［1］ 胡有谷. 腰椎间盘突出症，第2版［M］.北京：人民卫生出版社，1995：313.
［2］ 王 欢，郝立波，王海义. 血肿在硬膜外瘢痕粘连形成中作用的探讨［J］.中华骨科杂志，1998，18(3):161.
［3］ 彭力平，刘向前，罗毅文. 综合治疗腰椎手术失败综合征47例疗效观察［J］.湖南中医杂志，2001，17(4):23.
［4］ 孙 康，姜长明，吕德成，等. 预防椎板切除术后硬膜周围纤维化与粘连的实验研究［J］.中华骨科杂志，1995，15(11):728.
［5］ 刘郑生，朱盛修，卢世壁. 火器性周围神经震荡后神经内胶原含量测定的实验研究［J］.显微医学杂志，1985，8(1):26.
