毛金丝桃提取物的体外抗菌实验

           作者：朱明 熊元君 马秀敏 丁剑冰 古丽娜・沙比尔

【关键词】  毛金丝桃；,,,提取物；,,,体外抗菌实验

　　摘要：目的探讨新疆毛金丝桃醇提取物在体外抗菌作用。方法采用连续稀释法对毛金丝桃醇提取物进行MIC、MLC实验研究。结果毛金丝桃提取物在体外对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等有一定的抑制作用。结论毛金丝桃提取物对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等有一定的抑制作用，是具有开发价值的抗菌中草药。

　　关键词：毛金丝桃；   提取物；   体外抗菌实验

　　Antimicrobial Test in vitro of Extracts from Hypericum hirsutum L.

　　Abstract:ObjectiveTo explore the antinuzrobial altion of extracts from hirsutuml in rtro.MethodsThe MIC MLC experiments were carried out by serial dilution test.ResultsThe extracts have certain inhibition on Staphylococcus aureus, Escherichia coli aud. Pseudomonas aeruginosa.ConclusionThe extracts of hirsutuml have obvious inhibition some bacteria.

　　Key words:Hypericum hirsutuml;   Extracts;   Antimicrobial test in vitro
   
　　毛金丝桃（Hypericum hirsutum）是金丝桃属（Hypericum L）的一种，属于藤黄科（Guttiferae）。该属植物全世界约有400余种，其中我国约有55种、8个亚种，全国各地均有分布，尤以华东、华西、川北及新疆、贵州等地分布较为集中。该属植物多个品种为药用植物，传统中医学认为，具有清热解毒、收敛止血、利湿之功效，用于咯血、吐血、肠风下血、外伤出血、风湿骨痛、口鼻生疮等症［1~3］。近年来研究发现，该属植物中含有金丝桃素（Hypericin）和假金丝桃素（Pesudohypericin）具有抗抑郁、抗肿瘤、抗病毒、镇痛、抗菌消炎、创伤收敛等药理活性。其中毛金丝桃在新疆阿勒泰一带分布较多，在新疆民间广泛应用，但对其他抑菌实验方面的报道却很少，笔者采用连续稀释法对毛金丝桃乙醇提取物进行了抑菌作用的测定，现将结果报道如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  药材毛金丝桃的全草2004-03由新疆中药民族药研究所提供及鉴定，其在水中溶解度差，易溶乙醇。

　　1.1.2  90%乙醇提毛金丝桃药液的制备［4，5］称取一定量的毛金丝桃将其粉碎，过筛后得到粗粉20 g，加入90%乙醇100 ml，用超声波清洗器超声30 min后，在不断搅拌下浸提24 h，过滤所得滤液回收乙醇后，加热浓缩成浸膏，再加入蒸馏水15 ml，不断搅拌下浸提24 h，过滤所得滤液回收乙醇后，加热浓缩成浸膏，再加入蒸馏水15 ml，不断搅拌使浸膏溶解，并调整pH为7.4后，滤膜过滤除菌，配成2 g/ml醇提毛金丝桃药液15 ml，装入无菌棕色瓶中放置冰箱保存，于48 h内使用，以保证药效稳定。

　　1.1.3  菌种及培养金黄色葡萄球菌（ATCC29213）；绿脓杆菌（ATCC27853）；大肠杆菌（ATCC25922）；购自药品生物制品检定所，水解酪蛋白（MuellerHinton,MH）肉汤、琼脂培养基购自杭州生物试剂厂。实验菌种经传代纯培养后，取1接种环菌种接种于MH肉汤培养基中，37℃恒温箱培养6 h，经比浊法测定细胞数为109 CFU/ml，稀释至106 CFU/ml为工作浓度。通过倾注平板法计数，实验中每毫升液体培养基加入0.1 ml细菌液，37℃ 24 h恒温培养，计数后为最终实验浓度，其中金黄色葡萄球菌为3.6×105 CFU/ml；绿脓杆菌为3.5×105 CFU/ml；大肠杆菌为3.1×105   CFU/ml。

　　表1  毛金丝桃的抑菌实验（略）

　　“+++”细菌明显长；“++”细菌少量生长；“0”无菌生长

　　1.2  抑菌实验的方法与结果［6~10］采用液体培养基连续稀释法将被检药液用MH肉汤培养基作一系列倍比稀释为9管，使MH肉汤培养基含药浓度分别为133.3，66.5，33.25，16.63，8.31，4.16，2.08，1.04，0.52 mg/ml。第10管不加药液为MH肉汤培养基接种相同菌种作对照管，每支试管为1.8 ml，然后每支试管加入0.2 ml实验细胞液，置37℃培养24 h，肉眼观察试管混浊情况，能抑制实验菌生长的最低浓度为毛金丝桃的最低抑菌浓度（Minimal inhibition concentration,MIC）。结果见表1。将澄清的未长菌各试管中取0.1 ml培养液和10 ml营养琼脂分别倾注平皿中，混匀凝固后置37℃培养24 h（每管每个浓度均倒3块平皿）观察有无细菌生长，凡平板上无菌生长的该药物最低浓度为毛金丝桃的最低杀菌浓度（Minimal lethal concentration,MIC）。结果见表2。

　　表2  毛金丝桃的杀菌实验（略）

　　“+++”细菌明显生长；“++”细菌少量生长；“+”细菌少量生长；“0”取培养基再接种无菌生长

　　2  讨论

　　毛金丝桃在新疆有着悠久的用药，临床应用广泛，近年虽然在药研究方面做了大量工作并取得了一定成果，但对其在抑菌实验方面的报道却很少，本实验采用连续稀释法进行毛金丝桃MIC的测定，对了解毛金丝桃有无抗菌作用、抗菌效果如何，确定毛金丝桃的用药剂量和研究抗菌机理等方面具有重要意义。毛金丝桃在水中溶解度差，易溶乙醇，用乙醇提取后需回收乙醇，并使药液的pH接近中性，才能保持药物的稳定性又不致影响试验菌的生长，但中药制剂内往往含有鞣质，并且有特殊色泽，影响结果的判断，因此本实验还测定了毛金丝桃醇提取物在体外对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌均有一定程度的抑菌杀菌作用，毛金丝桃醇提取物对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌的MIC分别为（8.3，4.16，8.31 mg/ml）、MBC（16.63，18.31，16.63 mg/ml）。但是体外抗菌实验的环境与体内不同，因此该提取物还需进一步通过动物体内实验来证明其抗菌作用，为毛金丝桃抗菌药用价值的开发奠定基础。

　　：

　　［1］  药科大学,中国医药科技出版社.中药辞海，第2卷［M］.北京:中国医药科技出版社,1996：1176.

　　［2］  Zhou J,Wang C D.Analysis of active constituents included in Hypericum perforatum L.［J］.Chin Traditional Herb Drugs (中草药),1999,30(9):661.

　　［3］  Wang W H,Zhao Q Z.Determination of hypericin by High Performance Liquid Chrommatography［J］.J.Kunming University Sci.Tech (昆明理工大学学报),1999,24(5):121.

　　［4］  白  洁，杨得坡，王冬梅.贯叶金丝桃素的化学不稳定性及药理活性［J］.中草药，2004，35（3）：338.

　　［5］  熊元君,古丽娜・沙比尔,贾晓光,等.新疆三种金丝桃属植物中金丝桃素含量测定［J］.中草药，2003，34（9）：2.

　　［6］  李明远.微生物学与免疫学［M］.北京:人民卫生出版社,2002:84.

　　［7］  樊明涛,陈锦屏.百里香提取物抑菌特性的研究［J］.微生物学报,2001,41(4):499.

　　［8］  周邦靖.常用中药的抗菌作用及其测定方法［M］.重庆:技术文献出版社重庆分社,1997:1.

　　［9］  范青生,马振亚.防腐抑菌中药的微量快速筛选法研究及其应用［J］.微生物学通报,1991,18(2):114.

　　［10］  戴自英.临床抗菌药物学［M］.北京:人民卫生出版社,1985:128.