华支睾吸虫分泌-排泄抗原在血清学诊断中的意义

           作者：崔香淑，金元哲，李顺玉   

【关键词】  华支睾吸虫；,,分泌-排泄抗原；,,酶连免疫吸附法；,,诊断

　　摘要：目的评价华支睾吸虫分泌-排泄抗原在华支睾吸虫病血清学诊断中的价值，应用ELISA技术对华支睾吸虫的成虫粗抗原和分泌-排泄抗原的敏感性和特异性进行比较。方法制备华支睾吸虫的粗抗原和分泌-排泄抗原，以ELISA方法对华支睾吸虫感染患者509人、麝猫后睾吸虫感染者47人、卫氏并殖吸虫感染者20人、日本血吸虫感染者14人以及健康人血清163人，检测血清特异性IgG。结果比较华支睾吸虫分泌-排泄抗原的诊断的敏感性高于粗抗原，分泌-排泄抗原的特异性反应明显高于粗抗原。结论分泌-排泄抗原用于诊断感染华支睾吸虫病有较高的敏感性和特异性, 是一种有效的诊断抗原。

　　关键词：华支睾吸虫；  分泌-排泄抗原；  酶连免疫吸附法；  诊断

　　The Significance of Excretory-secretory Antigen of Clonorchis sinensis in Serological Diagnosis

　　Abstract：ObjectiveThe present study was undertaken to evaluate the diagnostic value of ELISA using excretory-secretory antigen(ESA) instead of crude antigen(CA) of Clonorchis sinensis. MethodsThe diagnostic sensitivity and specificity of crude antigen and excretory-secretory antigen of Cs were observed by ELISA. Sera of human infected with Clnorchis sinensis (509 cases), Opisthorchis viverrini (47 cases), Paragonimus westermani (20 cases) Schistosoma japonicum (14 cases) and serum of 163 healthy students were used for ELISA. ResultsThe diagnostic sensitivity of ELISA using excretory-secretory antigen was 92.5%, which was higher than that of ELISA using crude Clonorchis sinensis antigen(88.2%). In addithion, the specificity of excretory-secretory antigen was found 93.1% while that of crude antigen was 87.8%.ConclusionClonorchis sinensis ESA was found to be a better serodiagnostic antigen than CA for ELISA.

　　Key words：Clonorchis sinensis;   Excretory-secretory antigen;   ELISA;   Diagnosis
   
　　华支睾吸虫又称肝吸虫, 是一种严重危害人体健康的人兽共患寄生虫病。主要分布于东亚和华人社区, 估计有2 500万感染, 其内有1 000万感染者［1］。 华支睾吸虫病的诊断虽然做大便检查可以确诊, 但是因虫卵小, 容易漏诊, 并应注意与其他寄生虫的虫卵相鉴别。因此, 应用免疫学诊断方法检测肝吸虫抗体是重要的补助诊断仪据。 已经用于华支睾吸虫的检查方法有皮内试验、补体结合试验、血清凝集试验、对流免疫电泳及酶联免疫吸附 (ELISA)。其中ELISA 方法是敏感性和特异性较高的一种常用的检测手段。 目前, 最常用的ELISA 诊断抗原是粗抗原, 它具有较高的敏感性和特异性, 但和其他吸虫有交叉反应［2］。 最近, 国外已有报告华支睾吸虫的分泌-排泄抗原比粗抗原具有更高的敏感性和特异性［3］。本实验利用华支睾吸虫的粗抗原和分泌排泄抗原检测患者血清抗体, 评价了分泌-排泄抗原在诊断中的实用性。

　　1  材料与方法

　　1.1  华支睾吸虫粗抗原及分泌-排泄抗原的制备

　　1.1.1  粗抗原华支睾吸虫第二中间宿主麦穗鱼采自沈阳郊区，用人工消化法消化麦穗鱼,并收集囊蚴。兔子感染新鲜囊蚴, 三个月后牺牲并取出肝脏, 在解剖显微镜下分离虫体。用PBS（磷酸盐缓冲液,0.2 mol/L, pH7.2~7.4）冲洗新鲜虫体后,加入等体积的PBS, 用漩涡混合器打匀5min, 12,000 r/min离心30 min，收集上清液即为粗抗原。

　　1.1.2   分泌-排泄抗原及虫卵抗原 采集新鲜虫体用PBS冲洗3次,置0.01 mol/L pH7.2 PBS 培养液中（内含抗生素）37℃培养15h, 收集上清液,4℃ 3 000 r/min 离心 10min,　分离虫卵,并用12 000 r/min离心30min去除精子,取上清液为分泌－排泄抗原, 紫外分光光度计测定蛋白浓度，分装，-20℃保存备用。

　　1.2   待检血清华支睾吸虫感染血清509份取自黑龙江省肇源县。 这些感染者均有长期食用生鱼的，并粪检阳性。 163例健康者血清取自非流行区无病症且粪检阴性者作为阴性对照。其它相关吸虫患者血清作交叉反应实验: 麝猫后睾吸虫患者47例，日本血吸虫患者14例，卫氏并殖吸虫患者20例。 所有吸虫患者均经寄生虫病原学检测确诊。

　　1.3  ELISA实验将华支睾吸虫不同组织抗原用0.1 mol/L NaHCO3缓冲液（pH 9.6）稀释成10 mg/L, 每孔100 μl 包被96孔聚丙乙烯酶标板， 4℃过夜。 用含3% 脱脂奶粉的 PBS-Tween20 (PBST) (pH 7.2, 0.05%) 封闭37℃ 60 min。用 PBST洗涤5次, 加待测血清（华支睾吸虫，囊虫血清1∶25或卫氏并殖吸虫,裂头蚴血清1:100稀释）100 μl, 在37℃ 培养箱孵育60 min。用 PBST洗涤5次，加（1：500 00稀释）辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗人的IgG（US  Biochemical  Cooperation）100 μl, 在37℃ 培养箱孵育60 min。PBST洗涤5次,加底物 3，3’，4，4’-四甲基联苯胺（TMB）和0.1% H2O2，10  min。 用酶标仪(MK3型号, 芬兰) 在450 nm处测吸光度。 OD值小于0.25为阴性, 大于或等于0.25为阳性。

　　1.4  统计学分析所有统计分析均用SPSS 10.0统计软件进行，数据用平均数±标准差表示，并进行方差分析。

　　2  结果

　　结果见表1~3。用粗抗原检测抗体的ELISA法检测各组血清,阴性对照组的平均吸光值较低，为0.066±0.058, 且个体间差异较小,华支睾吸虫患者血清的平均吸光值为0.353±0.115,麝猫后睾吸虫患者血清为0.261±0.135, 日本血吸虫患者血清为0.093±0.124, 卫氏并殖吸虫患者与肝片形吸虫患者血清的平均吸光值稍高于0.1。而用分泌-排泄抗原检测抗体时,对照组血清样本的吸光值和粗抗原检测的吸光值在相似的水平上,华支睾吸虫患者血清的平均吸光值升高到0.404±0.129, 而其他吸虫患者血清的吸光值均有所下降。509例华支睾吸虫患者血清，449例在粗抗原检测抗体中为阳性,敏感性为88.2%；471例在分泌-排泄抗原检测时为阳性,敏感性为92.5%, 统计学上有显著性差异（P＜0.05）。在粗抗原和分泌-排泄抗原的ELISA检测中,对照组血清和肝片吸虫患者血清均末见交叉反应,但麝猫后睾吸虫患者血清在两种抗原检测中均有较高的交叉反应,日本血吸虫患者及卫氏并殖吸虫患者用粗抗原作检测交叉反应, 分别为7.1%（1/14）与25%（5/20）, 而用分泌-排泄抗原作检测,均末见交叉反应。分 泌-排泄抗原检测抗体的ELISA法特异性显著高于用粗抗原检测抗体的ELISA法（特异性分别为93.1%和87.8%）。

　　表1  华支睾吸虫粗抗原和分泌-排泄抗原吸光度的比较（略）

　　与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

　　表2  华支睾吸虫粗抗原和分泌-排泄抗原敏感性的比较（略）

　　与粗抗原体比较，*P<0.05

　　表3  华支睾吸虫粗抗原和分泌-排泄抗原特异性的比较（略）

　　与对照组比较，#P<0.05，**P<0.01

　　3  讨论

　　ELISA法已是最广泛地用于华支睾吸虫的免疫学诊断。 ELISA法所用抗原多为成虫可溶性蛋白抗原, 根据众多学者的研究和应用, 其敏感性可达83.1%~100%, 但与日本血吸虫, 肺吸虫有10%左右的交叉反应［4］。 为了提高ELISA 测定的特异性, 不同抗原已用于华支睾吸虫的诊断。有关华支睾吸虫特异性抗原包括全虫抗原、表皮膜抗原、代谢抗原、虫卵抗原及去膜虫体抗原等。其中已证明代谢抗原的血清敏感性较高,其抗原中可能含有高活性的组分［5］。本实验证实, 用华支睾吸虫粗抗原和分泌-排泄抗原作诊断抗原，以ELISA法诊断人体华支睾吸虫病及其他寄生虫病，其诊断的敏感性和特异性均分泌-排泄抗原优于粗抗原。 华支睾吸虫的分泌-代谢抗原的抗原条带为7-8 , 12.5, 17 及 26-28 kDa, 而粗抗原还可以观察到35, 43, 70 kDa, 其中7和8 kDa是主要成分［6］, 分泌-排泄抗原已被证实为急性感染期的有效诊断抗原［7］。 华支睾吸虫7-8 kDa可能是7和8 kDa的混合物，在免疫组织化学染色中，它们集中分布于体表及精子囊, 并已证明这些条带提高诊断的功效。分泌-排泄抗原的另一个成分是12.5 和17 kDa, 其中17 kDa蛋白质条带已被证明为半胱氨酸蛋白酶［8］。 这条带蛋白质抗原性并不强，但与其他吸虫有较普遍的交叉反应，因此从分泌-排泄抗原中能排除此成分将提高诊断的特异性。分泌-排泄抗原的第3种成分是26和28 kDa条带。 这两种条带是一种蛋白质类型，已证实为谷胱甘肽-S转移酶。这两种条带具有抗原性,与其他寄生虫有较低的交叉反应，已被看待为候补诊断抗原［9］。华支睾吸虫的分泌-排泄抗原用于ELISA检测中，可提高诊断的敏感性和特异性。分泌-排泄抗原的敏感性的提高可能与7-8 和26-28 kDa条带的高含量有关。粗抗原除了这两种抗原条带以外,还含有其他蛋白质条带,因此这些有效抗原成份很可能被稀释,导致敏感性的降低。已有报道华支睾吸虫粗抗原中35 和70 kDa 抗原蛋白与其他蠕虫有交叉反应［10］。分泌-排泄抗原含有较高的7-8 和26-28 kDa 抗原条带,但含有少量的35或70 kDa 蛋白质条带，因此可以提高诊断的特异性。ELISA检测特异性抗体已广泛应用于寄生虫病检查,包括华支睾吸虫病，而分泌-排泄抗原的应用将提高诊断的敏感性和特异性,但是获得充分的分泌-排泄抗原实际上有一定的难度。 在今后的研究中,确定分泌-排泄抗原的有效成分，研制重组蛋白将会弥补这些不足。

　　：

　　［1］  吴德,余新炳,吴宗道.华支睾吸虫病的流行概况［J］.热带医学杂志，2002， 2（3）:277.

　　［2］  Hong ST. Changes of anti-Clonorchis sinensis IgG antibody in serum after praziquantel treatment in human clonorchiasis［J］.Korean J Parasitol,2001,16：1.

　　［3］  Kim SI. A Clonorchis sinensis -specific antigen that detects active human clonorchiasis［J］. Korean J Parasitol， 36:37.

　　［4］  Rim HJ. Clonorchiasis in Korea［J］. Korean J Parasitol. 28 Suppl：63.

　　［5］  余海斯,周礼神.华支睾吸虫成虫四种抗原的免疫学特性比较［J］.  中华传染病杂志，1989，7（4）：212.

　　［6］  Chung YB, Lee M, Yang HJ, et al. Characterization of partially purified 8 kDa antigenic protein of Clonorchis sinensis［J］.Korean J Parasitol， 40：83.

　　［7］  Kim SI. A Clonorchis sinensis specific antigen that detects active human clonorchiasis［J］.Korean J Parasitol， 36: 37.

　　［8］  Chung YB, Kong Y, Yun DH, et al. Persisting antibody reaction in paragonimiasis after praziquentel treatment is elicted mainly by egg antigens［J］.Korean J Parasitol， 38: 75.

　　［9］   Kang SY, Ahn IY, Park CY, et al. Clonorchis sinensis: Molecular cloning and characterization of 28-kDa glutathiones S-transferase［J］.Exp Parasitol， 97: 186.
　　［10］   Hong ST, Lee M, Sung NJ, et al. Usefulness of IgG4 subclass antibodies for diagnosis of human clonorchiasis［J］ Korean J Parasitol， 37：243.