紫外分光光度法测定荔枝核抗乙肝成分的含量

【关键词】  荔枝核；,,抗乙肝；,,黄酮类；,,紫外分光光度法

　　摘要：目的研究荔枝核抗乙肝成分黄酮类化合物的测定方法。方法紫外分光光度法在510 nm处测定。结果建立了回归方程C（μg/ml） = 2.541 61 + 83.286 26 A, 相关系数r = 0.999 8，平均加标回收率为100.82%（RSD=1.59%）。测定荔枝核抗乙肝成分黄酮类化合物含量为7.13%。结论该方法简便，准确，可用于测定荔枝核抗乙肝成分黄酮类化合物的含量。

　　关键词：荔枝核；  抗乙肝；  黄酮类；  紫外分光光度法

　　Determination of the Content of Antihepatitis B Consituents in Litchi Seed by Spectrophotometric Method

　　Abstract：ObjectiveTo establish a method for the determination of the content of antihepatitis B constituents flavonoids in Litchi Seed.MethodsThe content of anti-hapatitis B consituents flavnoids in Litchi Seed was determined by spectrophtometric method at 510nm. ResultsThe regression equation C（μg/ml） = 2.54161 + 83.28626 A and R = 0.9998 of the relationship between concentration and absorbance were established. The average recovery was 100.82% and RSD was 1.59%. The content of antihepatitis B consituents flavonoids in Litchi Seed was 7.13%. ConclusionThe method is easy and accurate, and can be used for determination of the content of antihepatitis B consituents flavnoids in Litchi Seed.

　　Key words：Litchi Seed;   Antihepatitis B;   Flavonoids;   Spectrophometic method
   
　　荔枝核是无患子科植物荔枝的干燥成熟种子，主要分布在福建、、广西、广东等省。我国古代药典记载荔枝核性温，归肝、肾经, 能祛寒止痛。临床实验研究显示荔枝核能够降低血糖、调节血脂和提高抗氧化能力、抑制乙肝病毒的作用［1，2］。徐庆等［3］发现荔枝核中黄酮类化合物具有很好的抑制乙肝病毒表面抗原HBsAg的功效。目前除了少量荔枝核被药用外，大量荔枝核都被遗弃浪费。为了充分利用该资源、变废为宝、研究如何开发荔枝核抗乙肝成分黄酮类化合物很有意义和价值。天然药用植物中黄酮类化合物测定方法主要有紫外可见分光光度法［4］、高效液相色谱法［5］、薄层色谱法［6］等。国内外关于荔枝核中黄酮类化合物的测定方法尚未见报道，本文建立了铝盐显色分光光度法测定荔枝核抗乙肝成分黄酮类化合物的方法，并测定荔枝核抗乙肝成分黄酮类化合物的含量。

　　1  仪器与材料

　　1.1  仪器756MC紫外-可见光分光光度计（上海分析仪器总厂）；WS2-133-74多功能恒温水浴锅（广东汕头医疗器械二厂），Explorer－11140电子天平（瑞士OHAUS公司）。

　　1.2  材料荔枝核购自中药材公司，产地广西；芦丁对照品来自药品生物制品检定所；氯化铝、亚硝酸钠、氢氧化钠（分析纯）；95%乙醇；石油醚；水为蒸馏水。

　　2  方法与结果

　　2.1  测定方法依据以芦丁为对照品测定荔枝核抗乙肝成分黄酮类化合物的含量，加入铝离子试剂，同时控制适宜pH值，使黄酮类化合物与铝盐形成配合物在可见光区能获得稳定的特征吸收峰。

　　2.2  试样品溶液的配制荔枝核打成粉过40目的筛。取一定量的荔枝核粉，加入适量50％ 乙醇浸提。提取液过滤后加入石油醚萃取以除去酯类物质和色素，分液去掉石油醚层得到荔枝核黄酮类化合物的提取溶液。

　　2.3  对照品溶液的配制精确称取芦丁标准品10.00 mg, 用50%乙醇溶解后定容50.00ml，配制成芦丁50%乙醇标准溶液（0.200 mg/ml）。

　　2.4  检测波长的选择各取试样品溶液和芦丁对照品标准溶液少量，按2．5方法显色后在400~650 nm区间扫描，确定二者在510  nm处均有一强吸收峰(图1~2)，故选择510 nm 为测定波长。

　　图1  芦丁标样显色扫描曲线(略)

　　2.5  标准曲线的建立精确量取芦丁对照溶液 0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 ml于25 ml 容量瓶，加水至6 ml。加入5% NaNO2溶液1.00 ml, 混匀后放置6 min；再加入10%  AlCl3溶液1.00 ml，混匀后放置6 min；最后加入4% NaOH溶液10.00 ml显色，加水至刻度。静置15 mins后在510 nm处测定吸光度，以1号瓶为空白。绘制出吸光度-浓度标准曲线（图3）。用最小二乘法求出回归方程为：C（μg/ml） = 2.541 61 + 83.286 26A, 相关系数r = 0.999 8 ,P＜ 0.0001表明芦丁含量在线性范围8.00~48.00 μｇ/ml之间与吸光度呈良好的线性关系。

　　图2  荔枝核提取液显色扫描曲线(略)

　　图3  芦丁标准曲线(略)

　　2.6  准确性实验取荔枝核黄酮类化合物的提取液，加50％ 乙醇配成不同浓度的3种样品。取1ml样品溶液，按2．5显色测定A。结果见表1。实验显示5次测定A值变化很小，相对标准偏差（RSD）＜1.5% (n=5)，表明该方法准确性高。

　　表1  准确性实验结果(略)

　　2.7  稳定性实验取1ml的 1号样品显色后,每隔10 min测定1次A值。结果见表2。实验表明在30 min内A值保持稳定，1 h后A值下降约10%, 因此提取液显色后应在30 min内测定吸光度。

　　表2  稳定性实验结果(略)

　　2.8  加标回收实验取3号样品1 ml于25 ml，再加入芦丁标准溶液1.00, 2.00, 3.00, 4.00 ml，按2.5法显色测定总黄酮含量，加标回收率。结果见表3。

　　表3  加标回收实验结果(略)      
 
　　从表3可见, 总黄酮含量在线形范围(8.00~48.00 μg/ml)内，回收率在99.38% ~103.15%之间,平均回收率达到100.82%(RSD=1.59%)，表明该方法可以作为荔枝核中抗乙肝成分黄酮类化合物含量的测定方法。

　　2.9  荔枝核抗乙肝成分黄酮类化合物含量的测定荔枝核打成粉过40目的筛。平行取5 g荔枝核粉5份，加入50%的乙醇溶液100 ml，80℃回流提取两次，第1次6 h，第2次4 h。合并两次提取液，提取液加入石油醚萃取除去酯类物质。取一定体积的萃过液，稀释至一定倍数。吸取稀释液1 ml按上面的方法显色，测定吸光度，通过回归方程计算出稀释液中总黄酮的浓度。荔枝核中总黄酮含量按下式计算：
含量(%)=总黄酮的浓度×25×提取液的体积数×稀释倍数     荔枝核原料的质量×100%
 
　　表4是5次平行实验的结果。从表中可以看到荔枝核中抗乙肝成分黄酮类化合物的平均含量为7.13%，RSD=2.39%（n=5）。

　　表4  荔枝核黄酮类化合物含量(略)

　　3  讨论

　　3.1  采用紫外分光光度法测定荔枝核抗乙肝成分黄酮类化合物的含量具有快速、准确、重现性好的特点。

　　3.2  提取液显色前用石油醚萃取掉脂类物质和色素，减少了干扰，使含量测定结果准确性更高，重现性更好。

　　3.3  荔枝核抗乙肝成分黄酮类化合物的含量测定显示黄酮类化合物的含量较高，可以作为新的抗乙肝药物成分来源开发利用。

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　　［1］  潘竞锵, 郭洁文, 韩  超,等.荔枝核的药理实验研究［J］.新药杂志，2000，9（1）：14.

　　［2］  肖柳英，潘竞锵, 饶卫农，等.荔枝核对小鼠免疫性肝炎的实验研究［J］.中国新医药，2004，3（6）：7.

　　［3］  徐  庆，宋芸娟，陈全斌，等.荔枝核黄酮类化合物对 HepG2．2．15细胞系 HBsAg与 HBeAg表达及HV-DNA含量的影响［J］.第四军医大学学报，2004，25（20）：1862.

　　［4］  王仲英，李香兰. 马齿苋中黄酮类化合物含量的测定［J］.太原理工大学学报，2004，35（1）：95.

　　［5］  易  醒，谢明勇，王远兴，等.反相高效液相色谱法测定青钱柳中黄酮化合物含量［J］.南昌大学学报（理科版），2001，26（2）：161.

　　［6］  鲁鑫焱，赵怀清，张  超，等. 薄层色谱梯度展开法分离鉴定胡芦巴及其复方制剂中的薯蓣皂苷元［J］.色谱，2005，23（2）：216.