TGF-β1/Smads 信号通路与急性肺损伤纤维化的研究进展

急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome, ARDS）是继发于感染、休克等多种病理损伤的临床综合症，为重度的急性肺损伤(acute lung injury, ALI)。有研究报道在ARDS 的致死原因中难以控制的肺纤维化约占40%-70%[1]，而在参与肺损伤纤维化的细胞因子中，转化生长因子β1（TGF-β1）是最重要的细胞因子。Smads 则是细胞质内TGF-β1 的重要信号转导分子，目前对Smads 家族研究之所以成为热点,是因为其对阐明TGF-β1 与急性肺损伤纤维化的关系开辟了新的途径。故此，现本文就TGF-β1 及Smads 信号通路在急性肺损伤纤维化中作用的研究进展作一综述。
1 TGF-β1－Smads 信号通路概况
1.1 TGF-β亚型：TGF-β1 最早是由Delaro 和Todaro 于1978 年在研究病毒转化细胞过程中发现的，哺乳动物体内主要有3 种亚型，即 TGF-β1、2 和3 。TGF-β不同亚型在创伤愈合中的作用不同。如TGF- β1、2 有助于瘢痕组织形成，TGF-β3 具有抗瘢痕作用。
2.2 TGF-β的激活： TGF-β分泌后必须经过激活才能发挥效应，即 TGF 前体分子LTGF 必须激活为成熟的TGF-β形式才能与受体结合，然后激活信号转导通路。与大多数其他激素不同，成熟的TGF-β在分泌后仍然保持与它的前肽共价结合，成熟的TGF-β的这种复合物形式不能被信号受体识别，因此被称为TGF-β前肽。潜在相关肽(LAP) 与潜在TGF-β连接蛋白(LTBP)经二硫键共价结合，LTBP 有利于TGF- β／LAP 复合物的分泌、储存和激活。TGF-β的激活需要从蛋白氨基端去掉与LTBP 连接的羧基端前区，当LTGF 被蛋白裂解移至细胞外， TGF-β被激活。这是一个复杂的过程，涉及LTGF 构象改变。若机体受到炎症或损伤因素如内毒素[2]、纤溶酶、基质金属蛋白酶（MMP）、活性氧等刺激后TGF-β可被激活[3]。
另一个TGF-β激活剂是血小板反应蛋白（TSP-1），它具有调节细胞间的黏附、促进血管发生和基质再建的作用。TSP-1 在体外可以通过改变LAP 构象激活潜在的TGF-β，激活TGF-β的整合蛋白αV β6，后者正常时仅在上皮细胞少量表达，在感染或损伤时诱导表达。通过基因敲除动物的研究证实，整合蛋白αVβ6 诱导TGF-β的激活。整合蛋白αVβ6 -/- 动物可以抵抗大剂量博莱霉素诱导的肺损伤和纤维化[4]。
1.3 TGF-β受体：TGF-β受体(TGFR)有5 种不同类型(Ⅰ-Ⅴ型)，其中I 型、Ⅱ型是跨膜丝／苏氨酸激酶受体，其胞质区段有丝-苏氨酸激酶活性，与受体后细胞内通讯有关。如I 型受体胞内区外侧一段富含丝／苏氨酸残基称GS 区，是受Ⅱ型受体磷酸化激活的部位。而I 型、Ⅱ型受体细胞外区则富含半胱氨酸残基。Ⅲ型受体，亦称为β聚糖，是一个锚着蛋白多糖，无信号转导结构但可提高TGF-β对Ⅱ型受体的亲和力[5]。
1.4 TGF-β受体激活：TGF-β首先与相应的Ⅱ型受体识别结合而被磷酸化激活成为具有激酶的活性，再由活化的Ⅱ型受体募集I 型受体，并将I 型受体的GS 区磷酸化而将其激活，活化的I 型受体与下游底物相互作用，再将信号传递下去[6]。给予TGFβⅡ型受体的嵌合体能减轻整合蛋白αVβ6 对的TGF-β的激活，对博来霉素所致的肺损伤具有保护作用[7]
1.5 Smads 蛋白家族： Smads 家族蛋白在将TGF-β信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用，且不同的Smad 介导不同的TGF-β家族成员的信号转导。TGF-β作为配体形成的受体复合物，激活Smads 进入核内，共同激活或抑制它们调节的靶基因的转录。根据结构，Smad 蛋白分成R-Smad，Co－Smad 和I-Smad 3 个亚家族，至少包括9 种Smad 蛋白，用Smad l－9 表示，按功能分为3 类：即受体活化型或通路限制性Smad(R－Smads)、共同通路型Smad(Co－ Smad)和抑制性Smad(I－Smads)。R－Smads 能被I 型受体激活并与受体形成短暂复合物，它又分为两类，即由激活素TGF-β激活的 AR-Smads，包括smad 2、Smad 3：和由BMP 等激活的BR-Smads，包括Smad l、Smad 5、Smad 8 和Smad 9。Co－Smad 包括Smad4，是TGF- β家族各类信号传导过程中共同需要的介质。I－Smads 包括Smad 6 和Smad 7，可与激活的I 型受体结合，抑制或调节TGF-β家族的信号转导[8,9]。
2 急性肺损伤时TGF-β的变化
ARDS 的纤维化（pulmonary fibrosis, PF）是肺部炎症导致肺泡持续性损伤及细胞外基质（extra cellular matrix, ECM）细胞反复破坏、修复、重建及过度沉积的过程，是机体组织遭受损伤后的过度修复反应[10]。ARDS 病理过程分为渗出期、增生期和纤维化期[11]。以往研究认为肺急性炎症和纤维化可能是两个相对独立的过程，但近年资料表明，在ALI、ARDS 的早期TGF-β1 即被激活[12,13]，且肺纤维化程度与ARDS 的死亡率密切相关[14]。
研究表明:ARDS 患者早期肺泡灌洗液中即可发现高表达的TGF- β1，并且其高表达与随后的肺水肿形成、促炎性细胞因子的释放[7,15] 以及患者氧合指数降低均密切相关[15，16]。Beer 等[17]证实TGF-β能抑制肺表面活性物质的生成，并能增加Fas 诱导的肺上皮细胞的凋亡 [18]。多位学者发现不同因素诱导的急性肺损伤模型中肺组织TGF-β1 的含量均明显增高。例如，在机械通气诱导的大鼠急性肺损伤模型,Imanaka 等[19]发现肺组织TGF-β1 含量明显增高的同时伴随肺组织中性粒细胞浸润和巨噬细胞活化；在失血性休克肺损伤大鼠模型中，Shenkar 等[20]发现失血后1h 肺泡巨噬细胞的TGF-βmRNA 表达即明显增加，并可见大量中性粒细胞浸润和间质充血水肿。若给予TGF- β单克隆抗体肺组织的损伤程度可明显减轻。Wesselkamper 等[21]进一步证实，在镍所致ALI 中，给予TGFβⅡ型受体的嵌合体，能有效减轻镍所致的肺血管通透性的增高和肺水肿发生。
TGF-β具有多种生物学效应,不仅对多种炎性细胞如巨噬细胞和中性粒细胞或成纤维细胞有很强的趋化作用[22,23],还能刺激TNF-α， IL-1β，IL-6 等炎性细胞因子释放[24,25]。TGF-β可通过以下三种途径影响IL-6 的表达：(1)诱导细胞内H2O2 一过性增加。H2O2 可剂量依赖性诱导IL-6 的基因表达。而抗氧化剂则可抑制TGF-β诱导的IL-6 的基因表达；(2)刺激钙离子的内流，钙离子可增加IL-6 的表达，同时调节激活蛋白一1 的活性；(3)丝裂原激活的蛋白激酶参与了TGF- β所诱导的IL-6 表达[25]。
3 TGF-β对细胞外基质（ECM）合成的调控作用
急性肺损伤纤维化的发生是胶原蛋白等细胞外基质(ECM)合成与降解不平衡的结果，在ECM 降解过程中，金属蛋白酶起着非常重要的作用。 TGF-β是最强的细胞外基质沉积促进剂，使ECM 合成增加，而降解减少 [26]。TGF-β促进ECM 的合成体现在多个环节：其一是上调基质成分基因的转录和翻译等步骤。例如促使胶原、纤维粘连蛋白和基质金属蛋白酶－1 抑制剂的mRNA 表达水平增加 [27]，促进胞外基质受体的转录、翻译和蛋白形成，从而促进ECM 的沉积；其二是通过选择性抑制胶原酶的合成、诱导胶原酶抑制物的产生或抑制蛋白酶抑制剂表达与激活，最终使胶原降解减少、细胞外基质在肺内积聚，使肺泡壁增厚，促进纤维化形成。TGF-β对上述两类酶合成的影响一定程度上可根据编码这些蛋白的mRNA 表达水平得到反映。例如TGF-β 可刺激肺成纤维细胞产生胶原纤维，诱导I、Ⅳ胶原mRNA 表达；利用支气管滴注TGF-β的方法建立小鼠支气管周围纤维化模型，在使用TGF-β7 天，可检测到小鼠气道上皮I 、Ⅲ型胶原mRNA 表达明显增加[28]。TGF-βmRNA 及蛋白水平的增加均可上调大多数基质蛋白 mRNA 水平，导致蛋白合成的增加。
激活蛋白－1(activator protein．1，AP-1)是血小板凝血酶敏感蛋白，也是TGF-β的主要激活物。现有资料证实，TGF-β促进胶原基因转录的分子机制与Smad 家族的信号转导有关。 AP-1 被激活后，促使TGF-β与其细胞膜上的受体结合，将活化的信号传递至细胞内，细胞内的Smad 家族(smadl、2、3、4、6 等)将信号进一步传递到细胞核内，激活核内转录蛋白，即转录信号转导剂和激活剂 (signal transducer and activator of transcription，STAT)-1，启动胶原蛋白mRNA 的转录，合成胶原蛋白。
4 TGF-β1－Smads 对肺泡－肺毛细血管屏障功能的影响
ALI的本质是各种损伤因素导致的肺泡－肺毛细血管屏障功能受损，肺毛细血管通透性增高的血管渗漏综合征[29]。近年一系列均证实，TGF-β呈剂量依赖性引起肺血管内皮细胞通透性增高[30,31,32]。为进一步探讨TGF-β1 引起肺血管内皮细胞屏障功能障碍的分子机制，一些学者进行了相关研究。发现TGF-β 能调节细胞内多种信号途径，如细胞外信号调节激酶（MAPK，如P38，JNK，ERK）、Rho GTPase、蛋白激酶C、磷脂酰肌醇-3-激酶等。其中RhoA 是小G 蛋白家庭成员之一，能调节细胞骨架和细胞间连接，导致应力纤维形成[30,33]。由于激活后的RhoA 能产生许多生物学效应，包括细胞骨架的重构、转录因子的激活等，因此RhoA 又被称为肌动蛋白细胞骨架和细胞形态异质性的调节器。 RhoA 激酶拮抗剂Y-27632 能部分减轻TGF-β1 介导的内皮细胞通透性增高和细胞骨架的重构。 2006年Lu[34]等证实TGF- β1 通过SMAD2 磷酸化激活P38，进而诱导RhoA 活化和内皮细胞通透性增高，且TGF-β1 对RhoA 的激活有赖于P38 的活化，因为给予P38 活化特异阻断剂能部分抑制RhoA 的激活。同时Lu 还发现，TGF-β作用后0.5-1 小时SMAD2 磷酸化达峰值，4 小时后磷酸化水平下降。若应用SMAD2 iRNA 技术，那么TGF-β1 所致内皮细胞通透性增高的效应则被逆转，提示SMAD2 在TGF-β1 所致内皮细胞通透性增高机制中起主导作用。
5 Smads信号通路对肺损伤纤维化的影响
Smads 通路是TGF-β主要信号传导分子，近年离体实验表明， TGF-β1 处理后肺成纤维细胞中胶原纤维产生明显增多。为进一步探讨TGF-β1 上调Ⅰ型胶原的机制，Zawel [35]等发现TGF-β1 处理后肺成纤维细胞Smad3, Smad4 通路活化，进而启动TGF-β1 的靶基因 collal,timp-1[35,36]的转录，导致Ⅰ型胶原的表达增多，从而部分揭示了TGF-β1 促进ALI 向ARDS 和肺纤维化的机制。
Zhao 等[37]研究了博莱霉素诱导的大鼠肺损伤模型中Smad2、 Smad3 的表达，发现Smad3 mRNA 在博莱霉素作用后第3 天开始下降，一直持续到第8、12 天，而Smad2 基本保持不变。提示Smad3 的表达在肺纤维化中可能起重要作用。一个更重要的发现是，将携带小鼠 Smad7 cDNA、Smad6 cDNA 的重组腺病毒分别通过气管与博莱霉素同时进入两组小鼠肺内，结果Smad7 cDNA 重组腺病毒作用组与Smad6 cDNA 作用组相比，I 型前胶原mRNA 的表达和羟脯氨酸的含量下降，并且没有肺损伤纤维化的形态学变化；Smad7 的表达可以抑制博莱霉素引起的Smad2 磷酸化。提示Smad7 而非Smad6 可以阻止博莱霉素诱导的肺损伤纤维化。Smad7 可能成为肺纤维化的一个突破点[38]。
Smad3 基因缺陷小鼠和野生型小鼠分别气管滴注博莱霉素，结果前者与后者相比，I 型前胶原mRNA 的表达下降，肺组织羟脯氨酸含量降低，而且从形态学观察，Smad 3 的缺失相当程度上减轻了肺损伤纤维化。表明Smad 3 在博莱霉素诱导的肺纤维化中起一定作用，Smad 3 在肺损伤纤维化的治疗中可能具有一定的实用性[37]。
总之，TGF-β1－Smads 信号通路在ARDS 发生、发展中具有重要作用，但迄今为止它在急性肺损伤纤维化疾病中的确切机制仍不十分清楚，特别时在不同诱因所致ARDS 进程中，TGF-β与各种Smad 蛋白表达的定时定位，不同Smad 蛋白表达的意义，它们与其他信号通路是如何交叉，以及针对该通路的治疗等方面，尚有待进一步研究。相信随着研究的深入，对TGF-β及其信号蛋白的调控可能是今后ARDS 治疗新的有效靶点。