益阴明目合剂对高眼压大鼠超微结构的影响
【摘要】 目的：研究益阴明目合剂对实验性缺血大鼠视神经超微结构的影响。方法:用高眼压方法制作Wister大鼠眼缺血模型，分为6组，分别为空白组、造模组、预防组、益阴明目合剂低剂量组(低剂量组)、益阴明目合剂高剂量组(高剂量组)和复明片组，电镜观察各组大鼠的视神经超微结构。结果:预防组，高/低剂量组、复明片组视神经的显微结构均优于造模组，逊于空白组。结论：益阴明目合剂能有效改善视神经缺血缺氧状况，对青光眼后期造成的视神经损害有一定的作用。
【关键词】 益阴明目合剂 超微结构 视神经
Effect of Yiyinmingmu Decoction on Optic Nerve Morphology in rat with Experimental Ischemic Retinopathy
WANG Jing-bo，CHEN Mei-rong，LIU Bo-qin,LIN Hai-qing,YU Wen-zhou
1.The Affiliated Hopsital of Shangdong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250011,China；
2.Shandong University Medical School,Jinan 250000,China
［Abstract］Objective:Tto investigate the effect of Yiyinmingmu Decoction on optic nerve morphology in rat with experimental ischemic retinopathy.Methods:Sixty rats were randomly divided into six groups:Kongbai group,Zaomo group,Yufang group,Low Jiliang group,High Jiliang group,Fu Ming group.The rats were injured by increasing intraocluar pressure of eyes.The microstructure and ultrastructure of the optic nerve were observed with election microscope.Results:The optic nerve ultrastructure in the rats fed with Yiyinmingmu Decoction and Fuming pian is better than the zaomo group and less than the kongbai group.Conclusion:Yiyinmingmu Decoction can relive the experimental ischemic retinopathy significantly,indicating a promising therapeutic effects on ischemic damage of optic nerve because of glaucoma.
［Key words］Yiyinmingmu Decoction;ultrastructure;optic nerve
青光眼是重要的致盲性眼病，中晚期青光眼引起的严重视功能损害目前仍无确切可靠而有效的方法，近年来我们运用中药益阴明目合剂治疗该病取得了满意的临床疗效。本课题通过观察益阴明目合剂对高眼压大鼠超微结构的影响，进一步探讨其作用机制，为临床应用提供依据。
1 实验材料
实验动物Wister大鼠60只,体重(220±20)g，无眼疾，雌雄兼用(山东大学实验动物中心提供，合格证号:鲁动质字［20040143］号)。实验动物及实验所用条件符合国家技术委员会的《实验动物管理条例》。
药品及试剂：益阴明目合剂由黄精、枸杞子、五味子、石菖蒲、当归、知母等组成。经水煮浓缩为含生药2g/ml(山东中医药大学附属制剂室提供，批号2000712)。复明片(由西安碑林制药厂生产，批号ZZ?4366?陕卫药准字1992第00233号)。
2 实验方法
2.1 模型制作与取材
60只Wister大鼠随机分为空白组、造模组、预防组、益阴明目合剂低剂量组(低剂量组)、益阴明目合剂高剂量组(高剂量组)、复明片组。其中空白组行正常喂养20d；造模组高眼压造模后喂养20d；预防组益阴明目合剂按照2ml/kg喂养20d，高眼压造模后喂养20d；益阴明目合剂低、高剂量组造模后分别以5ml/kg、10ml/kg喂养20d，复明片组造模后按照0.15g/kg喂养20d。
造模方法为0.5％戊巴比妥10ml/lkg腹腔注射麻醉加眼球表面麻醉后，将连接生理盐水输液管的7号输液针头直接刺入Wister大鼠双眼前房，输液瓶距大鼠双眼高度为145cm，此时在眼内形成约110mmHg的眼压，可观察到球结膜苍白，眼底血流中断，视神经网膜缺血。加压1.5h拔出针头。每组喂养完毕后，取双侧视盘筛板后视神经纤维，约1mm×2mm大小，迅速置入3%戊二醛固定液，4h后入磷酸缓冲液(PB)并置4℃冰箱保存。
2.2 透射电镜标本的制备与观察
在视盘筛板后视神经纤维标本中，每组随机选取5例，进行常规超薄切片制备：3%戊二醛和1%锇酸双固定，逐级乙醇和丙酮脱水，Epon812环氧树脂包埋，LKB-Ⅲ型超薄切片机切片(厚度约70nm)，醋酸双氧铀和枸橼酸铅双染色，JEM-1200EX电镜观察并拍照。
3 实验结果
预防组、低、高剂量药物干预组，复明片组的视盘筛板后视神经纤维均好于模型组，略差于空白对照组。
3.1 对照组
图1髓鞘膜完整，没有明显异常；轴索中微丝微管排列规则，线粒体结构清晰，嵴形态正常。 神经纤维间胶质细胞的细胞器丰富，可见细胞核、内质网、高尔基复合体、线粒体、溶酶体等，其超微结构正常。
3.2 模型组
图2髓鞘膜完整；轴索中微丝微管排列紊乱，线粒体肿胀或局部空化，嵴结构缺失。神经纤维间胶质细胞的细胞器稀疏，核周池肿胀形成多个大泡，内质网和线粒体肿胀嵴结构缺失，其超微结构异常。图3低倍下另一个视野。髓鞘膜断裂、扭曲、层面分离；轴索中微丝微管缺失、线粒体肿胀或空化，以至整个轴索被均匀的高密度物质占据，超微结构极度异常。
3.3 预防组
图4髓鞘膜完整；轴索中微丝微管排列规则。神经纤维间胶质细胞的细胞器丰富，超微结构基本正常，核周池与部分内质网和线粒体有轻度肿胀或模糊。图5髓鞘膜完整；轴索中微丝微管排列规则，大多数线粒体结构清晰，嵴形态正常。
3.4 低剂量药物干预组 图6髓鞘膜完整；轴索中微丝微管排列规则。神经纤维间胶质细胞的细胞器可见，核周池、内质网和线粒体肿胀。图7低倍下另一个视野，大部分髓鞘膜完整；轴索中微丝微管排列规则，线粒体结构基本正常。仍有一些髓鞘膜断裂、扭曲、层面分离；轴索中微丝微管缺失、线粒体肿胀或空化，以至整个轴索被均匀的高密度物质占据。
3.5 高剂量药物干预组
图8髓鞘膜完整；轴索中微丝微管排列规则，线粒体结构基本正常。神经纤维间胶质细胞的细胞器可见，核周池、内质网轻度肿胀。 图9低倍下另一视野，髓鞘膜完整，没有明显异常；大部分轴索中微丝微管排列规则，线粒体结构清晰，嵴形态正常。仍有一些髓鞘膜扭曲。
3.6 复明片干预组
图10髓鞘膜完整；轴索中微丝微管排列规则，线粒体结构基本正常。神经纤维间胶质细胞的细胞器丰富，核周池、高尔基复合体、内质网有轻度肿胀。 图11低倍下另一视野，髓鞘膜完整，没有明显异常；大部分轴索中微丝微管排列规则，线粒体结构清晰，嵴形态正常。仍有一些髓鞘膜扭曲。
4 讨论
在发生青光眼疾病时，眼压升高能造成视神经缺血缺氧性损害，笔者应用电镜技术从形态学角度证实这一点，并初步探讨了中药在预防和该损害方面的作用。决定眼内组织局部血液供应的因素包括灌注压和局部阻力，眼的灌注压等于局部血压与眼压之差，当发生青光眼时，眼压升高，局部灌注压降低甚至接近于零，此时眼的自动调节机制无法调节眼内组织的血供，眼内组织发生缺血缺氧。因此缺血缺氧成为青光眼重要的病理改变。笔者采用了电镜的样品制备方法,既提高了光镜照片的分辨率,又可使显微和亚显微结构对应分析。电镜观察结果显示:预防组、低/高剂量组、复明片组显微结构均好于模型组，能显著改善视神经的纤维鞘膜、微丝微管，线粒体得到很好的修复，显著改善了视神经缺血缺氧损害。其中高剂量组对髓鞘膜、微丝微管及线粒体的改善明显好于低剂量组，临床应用可选用高剂量对患者进行治疗。预防组和高剂量改变相似，以预防为主治疗时较小剂量即可以达到很好效果。高剂量与复明片比较相似，对高尔基复合体的改善略强于复明片，其机理有待于进一步研究。
药理研究表明，本方中的单味中药或组方用药具有清除自由基的作用。金昔陆［1］采用离体大鼠肝线粒体膜的脂质过氧化模型和黄嘌呤氧化酶-鲁米诺化学发光法，研究来自内南五味子的戈米辛J对脂质过氧化的影响和清除超氧阴离子自由基(O-2)的能力，结果表明戈米辛J具有抑制羟自由基(OH·)诱导的脂质过氧化和清除O-2的作用。五味子能提高血清SOD活性，对氧自由基具有显著拮抗作用,减轻脂质过氧化对组织或细胞的损伤，增强机体对自由基损伤的防御机能［2］。马志茹等［3］通过单扫示波极谱法检测枸杞子和黄精对O-2和羟自由基(OH·)的抑制作用,来研究枸杞子和黄精对活性氧自由基(O-2和OH·)的清除作用，结果表明，枸杞子和黄精对O-2和OH·具有明显的抑制作用，枸杞子和黄精都能有效地清除活性氧自由基，具有抗氧化作用。
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［1］金昔陆.内南五味子木脂素戈米辛J对肝线粒体膜脂质过氧化和超氧阴离子自由基的作用［J］.药通报，2000,16(1)：26-28.
［2］郭 琼，赵保路，侯京五，等.五味子酚对突触膜脂质过氧化损伤保护作用的ESR研究.神经解剖学杂志，1995，11(4)：331-335.
