异种脱蛋白骨复合物修复大段骨缺损的血管化观察

            作者：简月奎，李起鸿，刘雷，杨柳

【摘要】  ［目的］探讨异种脱蛋白骨(heterogeneous deprotein bone，HDPB)复合物修复胫骨大段骨缺损过程中的血管化实验研究，为异种脱蛋白骨的临床应用提供实验依据。［方法］山羊24只，在右侧胫骨中下段截除胫骨总长度20％形成节段性骨缺损，实验组18只，植入异种DPB+自体MSCs+rhBMP2，用半环槽式外固定器固定。于术后每隔4周对3只进行股动脉墨汁灌注后处死，取新骨组织制成厚切片观察血管化情况，以另6只植入自体骨为对照。［结果］术后4～24周，实验组与对照组血管表现数目逐渐增多，排列渐趋规则，血管大小、分布区域趋向均匀。测量血管数目和面积，结果显示4～24周2组血管数目和面积统计学分析差异无显著性意义(P>0.05)。［结论］异种脱蛋白骨复合物修复大动物大块骨缺损过程中血管化程度与自体骨相当，可以作为组织工程支架材料，并对其免疫原性和成骨能力等性能进行进一步研究。

【关键词】  异种脱蛋白骨；骨缺损； 血管化； 骨组织工程

　　创伤、感染和肿瘤等造成的大块骨缺损修复是骨科的难题。自体骨、同种异体骨、异种骨作为骨移植材料均有一定的局限性。组织工程技术的兴起为骨缺损修复带来新的希望，支架材料是骨组织工程研究的重要内容，制备来源丰富、价格低廉、性能优良的支架材料是研究热点之一。近年来虽有异种骨作为骨移植的替代材料的许多研究，如Keil骨、Bio?Oss骨等［1］，但没有完全解决异种骨的免疫原性及生物力学性能等问题。植入后移植物血管化较慢，而血管化快慢是关系移植物成活及成骨能力大小的重要因素，如成骨能力差，只能修复小段骨缺损或小动物骨缺损。异种骨修复大动物大段骨缺损过程中血管化研究报道较少。本实验以本科研制的改良法［2］制备异种脱蛋白骨作为组织工程支架材料修复大动物长骨大段缺损，并与自体骨移植作比较，观察其成骨过程中血管化，结果令人满意，现报道如下。

　　1  材料与方法
　　
　　1.1  主要仪器和试剂
   
　　市售猪股骨;市售墨汁；20%甘露醇(西南药业公司)；10％甲醛、浓盐酸、三氯化铁(重庆化学试剂厂)；半环槽式外固定器(第三军医大学李起鸿教授研制)；超低温冰箱(NUAIR，USA)；速眠新(军事医学院军事兽医研究所)；肝素钠(天津生化制剂厂)；氯胺酮(江苏恒瑞医药股份有限公司)。
　　
　　1.2  异种DPB的制备
   
　　参照改良法［2］制备，将制备的猪DPB放入-80℃超低温冰箱冷冻3个月后取出，在-700 mmHg真空下包装，60Co照射后置-4℃保存。DPB于术前浸入含rhBMP2浓度为75 ng／ml［3］溶液中2 h备用。

　　1.3  实验动物分组
    　　
　　山羊(第三军医大学动物实验中心提供)，10～12个月龄，雌雄不限，分笼喂养，体重(22.5±2.5)kg。随机均分2组，按植入材料分为实验组(异种DPB+自体MSCs+rhBMP2)和对照组(自体骨)。

　　1.4  山羊MSCs培养及与异种DPB复合
    　　
　　分离培养、收集山羊MSCs，调整细胞浓度为1.0×106／ml，将细胞悬液接种于异种DPB／rhBMP2上，2 ml／块，放入37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养6 h再加含15％FBS的DMEM／F12培养基1 ml，2～3 d后常规换液。

　　1.5  动物手术
   
　　术前拍双侧胫骨X线片，测量胫骨干长度，所有动物骨缺损制备和外固定相同，操作由同一组人员完成。半环槽式外固定器固定，所有螺母旋紧。根据X线片得到的胫骨长度，右侧胫骨中下段造成20％骨和骨膜段缺损［4］，据分组植入不同的植入物，其中MSCs均来自山羊自体骨髓。术后每隔4周摄肢体正侧位X线片。肌注速眠新0.08 ml/kg，麻醉后固定，常规条件摄片。

　　1.6  配制墨汁及灌注
   
　　市售墨汁过滤后，按7∶2∶1的比例将墨汁、10％甲醛和20％甘露醇混合配制成灌注液，6层医用纱布过滤，用前恒温水浴加热至38 ℃。速眠新0.08 ml／kg与氯胺酮2 mg/kg肌肉注射复合麻醉后固定，肝素1 000 U／kg肌注全身肝素化，在腹股沟区切开皮肤、皮下组织，游离股、静脉。结扎股动脉、离断，远端插管、固定；结扎股静脉、离断，远端切开放血。快速向股动脉远端推注大量肝素生理盐水(每500 L生理盐水中加入肝素12 500 U)冲洗直至股静脉流出清亮液体为止。然后从股动脉注入38℃墨汁灌注液至股静脉流出黑色液体，皮肤趾甲变黑，结扎股动、静脉。处死山羊，取下胫骨，低温放置24 h后10％甲醛溶液中固定2周。进行大体解剖及厚切片观察新骨血管化情况。

　　1.7  大体解剖观察
   
　　切开皮肤，暴露皮下组织和肌肉及剔除肌肉暴露骨膜，观察皮下组织、肌肉和骨膜血管网。

　　1.8  墨汁灌注厚切片血管计数和血管面积图像分析观察
   
　　取不同时间点新骨2％EDTA脱钙，以针刺时似软组织手感后，香柏油浸泡5 d。切取脱钙后新骨不同层面的横、纵切面，制成50～100 μm厚切片，每个标本分别随机抽取新骨两端及中间的横切片各5张，观察新骨血管网，并用Image?proplus真彩图图像分析软件测量血管数目和面积。

　　1.9  统计方法
   
　　采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，数值以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析进行比较。

　　2  结果
　　
　　2.1  术后观察
   
　　所有实验山羊术后伤口无溃烂、流脓，无死亡。2～6 h苏醒，并能站立进食。螺母松动后及时旋紧，无外固定松动失败，皮肤无坏死。2 d内伤肢能落地，但不能负重，2周后可以部分负重，3周能轻微跛行，4周后能自由活动，无跛行。

　　2.2  大体解剖观察
   
　　肌肉和软组织已经被墨汁黑染，皮下、肌肉筋膜和骨膜可清楚的观察到血管大小、分支、走行方向及相互吻合呈网状。

　　2.3  影像学观察
   
　　术后4周骨缺损区出现植入物边缘毛糙，8周出现大小不等、形状不规则的透光性骨吸收区。术后12、16、20、24周，2组表现为时间依从性的骨修复，表现为骨缺损区两断端之间高密度钙化影，新生骨与两断端完全相连接，大部分塑形，可见髓腔影(图1)。

　　2.4  墨汁灌注后切片观察
   
　　术后4周，实验组新骨边缘血管纤细，数目较多，显影不清，分布不均，中心部分血管缺如，中心与边缘分界明显(图2)；术后8周，新骨中心部分出现纤细小血管，数目较少，分布不均，中心边缘分界较明显(图3)。12周新骨中心部分血管粗细不一，血管扭曲，分布也不均匀，排列紊乱，中心与边缘分界较明显(图4)。16～24周新骨血管数目逐渐多，相对均匀，吻合成网，排列趋向规则(图5～7)。在同一时间点，对照组与实验组图像相似，但对照组血管数目略多，分布相对均匀，排列相对规则。Image?proplus真彩图图像分析软件测量血管数目和血管面积统计学分析如表1。4～24周，不同时间点血管数目(表1)和面积(表2)两者统计学分析差异无显著性意义(P>0.05)。

　　表1  2组术后不同时间点新骨血管数目比较（略）

　　2组比较：▲P>0.05

　　表2  2组术后不同时间点新骨血管面积比较（略）

　　两组比较：▲P>0.05

　　3  讨论
   
　　异种骨的应用主要是免疫原性和成骨能力，而移植后的血管化及其速度是评价去除免疫原性程度的一项重要指标，去免疫原性的程度能为受植的动物所耐受。对新骨能否生成，血管化过程对骨再融合方式起决定性作用［3］，以往作为骨移植材料制备的异种骨多作为单纯的充填物，或添加自体细胞或生长因子进行研究，这些实验在小型动物实验或大型动物小段骨缺损修复取得了成功［4］。在修复骨缺损的部位上，李晓辉等［5］添加碱性成纤维细胞生长因子与部分脱蛋白骨复合修复家兔股骨头缺损取得良好的效果，但在大型动物的大段骨缺损，特别是在血供较差，肌肉覆盖较少的胫骨中下段修复报道较少。作者的改良法在制备过程中尽量保留胶原蛋白，去除非胶原蛋白、肽类及脂类、细胞等，显著降低了抗原性，同时保留了良好的力学强度、天然的网状孔隙系统，为细胞的黏附、增殖及分化提供良好的三维空间结构，并加入骨诱导性细胞因子rhBMP2，在植入前复合山羊自体MSCs，使复合物既具有骨传导性，又具有骨诱导性，促使其成骨能力增强。在一系列理化性能检测、安全性及小动物免疫原性及成骨研究的基础上［6］，本实验在修复羊胫骨干大段骨缺损过程时对组织工程骨的血管化问题进行了研究，结果显示，所有实验组山羊术后伤口无溃烂、流脓，无死亡，影像学显示对骨缺损有完全修复。血管化过程表现为血管数量逐渐增多，血管分布逐渐均匀。血管面积图像分析结果显示实验组与自体骨移植修复组比较，2组新骨的血管化程度经统计学分析差异无显著性意义(P>0.05)，表明本组研制的异种脱蛋白骨复合物修复大动物长骨大段缺损的血管化，其血管化与自体骨相当。实验结果证实，所制备的异种脱蛋白骨免疫原性较低，能够用于修复大动物长骨大段骨缺损，血管化速度及程度与作为金标准自体骨移植相比无显著性差异。为临床大段骨缺损修复提供实验依据。关于异种脱蛋白骨复合物在临床骨缺损的修复中的应用，尚有待进一步研究。

【】
  　［1］ Valentini P,Abensur D, Densari D,et al.Histological evaluation of Bio?Oss in a 2?stage sinus floor elevation and implantation procedure:a human case report［J］.Clin Oral Implants Res,1998,9(1):59-67.

　　［2］ Lei L,Kanglai T,Liu Y, et al. Study of biological safety of scaffold material with heterogeneous deproteinized bone［J］.Chinese Journal of Traumatology,2006,9(4):234-237.

　　［3］ 杨志明，樊征夫，解慧琪，等．组织工程化人工骨血管化研究［J］．中华显微外科杂志，2002,25(2)：119-122．

　　［4］ 李建军，王文军，韩冬，等．转染骨形态发生蛋白-2基因的人骨髓间质干细胞复合异种骨支架异位成骨的效果［J］．中华创伤杂志，2004，20(6)：347-350．

　　［5］ 李晓辉，宋跃明，龚跃昆，等．复合部分脱蛋白骨修复兔股骨头骨缺损的作用机理及相关性分析［J］．矫形外科杂志，2005，13(13)：1010-1014．

　　［6］ 刘雷，李起鸿，唐康来，等．异种脱蛋白的生物相容性研究［J］．第三军医大学学报，2006，22(28)：2227-2229．