骨关节炎动物模型的建立及选择
作者：翟吉良，翁习生，邱贵兴
【关键词】 骨关节炎动物模型的建立及选择
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是以关节软骨退变、关节缘骨质增生为主要改变的疾病，临床尚缺乏根治措施，建立动物模型是研究OA发病机制、及预防的必要手段。
OA分继发性和原发性，故OA动物模型可从制作方法上分为两大类：一类为诱发模型，即通过各种操作方法如关节制动、手术、关节内注射物质等诱导OA产生；另一类为自发模型，即不用任何外界干预，动物自发产生OA，如C57黑鼠、STR／ort小鼠等；除以上两类模型外，还有一种模拟骨关节炎模型的方法，即关节软骨细胞体外培养。
1 诱发模型
1.1 关节制动
根据其制动位置可分为屈曲位、中间位、伸直位，伸直位时尚可施加外力挤压；将动物的关节长期固定于某一位置后，由于关节应力的改变可产生关节软骨退变进而形成OA。屈曲位时因减少了横跨膝关节的肌肉的收缩而导致关节软骨的萎缩性变化；若以伸直位制动，限制了关节的运动，肌肉、关节囊收缩，对关节面产生了过度压力，导致了OA的发生〔1〕；伸直位并施加压力时因增大关节面压力而进一步促进OA的形成。Evans等〔2〕观察发现家兔膝关节制动60 d后，大部分关节软骨的变化无法逆转；若制动不超过30 d，病变则有恢复的可能〔3、4〕。对人膝关节制动后，其关节软骨的病变与动物实验中所见到的改变相似。动物实验表明，无论是短期的反复制动或是持续性制动，若制动时间超过30 d，则可导致进行性OA的发生。在研究临床OA的发病机制及治疗反应时，将兔膝关节于伸直位制动5～6周是较好的OA动物模型制作方法之一〔6〕。尚平等〔5〕比较过屈位和过伸位固定制作OA模型的优劣，结论是两者均能成功制作OA模型，但前者简便、固定牢靠、耗材少、家兔适用性好、成功率高。
1.2 手术方法
1.2.1 关节内手术
1.2.1.1 前交叉韧带或（和）半月板切除
关节不稳定时由于关节应力发生变化（局部增大或减小）会造成关节的退行性改变，从而导致骨关节炎的发生。Pond等将犬膝关节前交叉韧带切断，观察到实验肢体的过程和发生（前交叉韧带破裂所致）关节不稳定是一样的，并且其最后的肉眼病理表现与骨关节炎是一样的〔3〕。王君等〔6〕在切除兔前交叉韧带的基础上固定手术对侧肢体使手术侧肢体过度负重形成兔膝负重模型，该模型造模时间较单纯切断前交叉韧带造模时间短。Moskowitz等〔3、7〕将兔膝关节半月板部分切除来造成关节的不稳定，从而得到骨关节炎模型；仅切除内侧半月板，半年后也可出现类似早期OA的形态学和生化改变；单纯半月板切除可减轻手术造成的损伤，但造模时间也相应延长。去神经支配本身不引起关节退变，但能加速交叉韧带或半月板切除动物模型的关节退变〔3〕。
1.2.1.2 切除兔后肢膝关节籽骨韧带3～4 mm或腓侧韧带3～4 mm和前外侧半月板4～5 mm，以及部分或全部切除髌骨，均可导致不同程度的OA改变〔8〕；股骨髁切除亦可导致OA的形成〔9〕。
1.2.1.3 Hulth模型
此为经典手术造模方式，具体步骤为：将动物麻醉后仰卧于手术台上，无菌条件下取膝关节内侧纵切口长约2 cm，显露膝关节，然后切断前后交叉韧带及内侧副韧带，完整切除内侧半月板，保留关节软骨面。术后不固定伤肢，自由活动，可适当给予抗生素预防感染〔10〕。胡阿威等〔11〕在Hulth模型基础上进行了改良，即按Hulth法行动物手术后7 d驱赶动物，每日30 min，分2次驱赶，驱赶动物4周后即得明显的OA模型。
1.2.1.4 关节划痕
在幼犬的关节软骨上用圆绞刀造成广泛且深度不等的软骨及软骨下骨缺损，2周后局部出现软骨细胞变性、基质中异染物质丧失〔1〕。为避免关节内划痕关节内操作对OA模型的影响，Marijnissen等〔3、12〕提出一种新的关节刻痕OA模型，方法是在狗的膝关节股骨髁上刻痕，不损伤软骨下骨，术后将对侧肢体固定于躯体上，迫使手术肢体负重，每周3 d，每天4 h，共20周。20和40周（后20周正常负重）后，关节软骨的生化表现与临床非常相似，并且关节炎症很轻微。由于关节的退变由一过性软骨损伤造成的，且炎症反应轻微，认为这是一个观察OA早期表现及治疗效果的理想模型，尤其是观察主要针对软骨保护和修复的治疗措施疗效时更为敏感。与切断前交叉韧带造模相比，关节划痕造模（Marijnissen法）对于观察治疗效果更好，因为前者关节不稳定持续存在从而影响治疗效果的观察〔12〕。
1.2.2 关节外手术
1.2.2.1 改变关节应力
（1）增加关节应力：陈宝兴等〔3〕用出生后1周内的Wistar种大鼠，结扎其双前肢及尾部，常规饲养，由于大鼠直立的异常体位，使髋关节应力增加从而产生OA。
（2）降低关节应力：王胜等〔13〕用手术方法延长兔髌韧带3 mm，降低髌股关节压力，术后6周开始出现软骨细胞增生、排列紊乱；16周时软骨已明显变薄，并且出现纵裂纹和胶原纤维增粗、断裂。由低应力导致的软骨退变早期，软骨细胞缺乏软骨退变中常见的代偿性增生表现说明低应力可能对软骨退变修复有抑制作用。
1.2.2.2 臀肌切断
关节生物力学的紊乱是骨关节炎主要病因之一，但关节内手术途径所得到的OA模型不能排除手术所致创伤性滑膜炎对实验的千扰，因此白希壮等采取完全切断豚鼠附着在髂嵴上的臀大肌及深部的臀中、小肌，切除远侧断端1 cm，从而获得满意的髋OA模型〔3、14〕。
1.2.2.3 破坏关节血液循环
关节局部的血液循环异常也是关节的致病因素之一。结扎狗膝关节周围的静脉可导致关节软骨的局部损伤和变性；结扎大鼠股静脉并切除1 cm且切断髂内静脉、切除踝至膝部的大隐静脉，8周后可见关节软骨的钙化层增厚、新骨形成、松质骨硬化，与临床OA的变化相似〔1〕。刘蜀彬等〔15〕采用阻断成年大耳白兔干骺端髓内血运成功地诱发骨关节退行性病变。其方法为：将成年大耳白兔于右侧股骨下端外侧切开皮肤、皮下组织，于关节外分开肌肉，显露股骨下端，以骨钻将股骨干骺端钻一直径0.5 cm之骨圆窗，将该处髓质刮除，直达对侧骨皮质，以骨蜡填塞，阻断股骨干骺端的髓内血运，缝合伤口。在左侧股骨下端外侧做同样手术切口，但不做骨的开窗，缝合切口，做为对照组。该方法短期内可获得满意的早期骨关节炎病变的动物模型、无滑膜炎症的影响且由于干骺端血供并非完全阻断，因此模型具有一定的仿真性、对关节未造成不可逆转的影响有利于后续实验。
1.2.2.4 卵巢切除
Pernille等〔16〕将Sprague?Dawley鼠卵巢切除制作绝经后骨关节炎模型，结果表明代表软骨变化的CTX?Ⅱ（collagen type Ⅱ degradation products）及代表骨吸收的CTX?Ⅰ较对照组明显升高，且第4周时两者的水平及此时关节变化与关节最终的变化呈明显相关性；该模型为研究雌激素及其类似物质对关节软骨保护作用的有用模型。
1.3 关节腔注射物质
1.3.1 尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）
石辉等〔17〕利用关节腔注射尿激酶的方法制作兔骨关节炎模型，实验12周即可完成，其方法为：实验组在右膝关节内注射uPA 0.4 pg／0.2 mL，对照组注射等容量的生理盐水，注射完成后在4、8、12周分批取兔滑膜进行组织学观察、取软骨行组织学观察及电镜检查，12周形成的关节炎模型与符合OA的组织病理特征。
1.3.2 木瓜蛋白酶（papain）
Havdrup等〔18〕以20％的papain 0.2 ml注射入兔膝关节2周后即可见关节软骨退变、成骨细胞活动、骨赘形成，而注射浓缩papain后2 d即可见关节软骨退变，注射后3 d可见成骨细胞活动，1周后可见骨赘形成；前者退行性变较后者明显。以4％的papain 0.3 ml分别于实验的第1、4、7 d注入兔髋关节中，可制作稳定的退行性关节炎〔8〕。杨峰等〔19〕于兔颞颌关节内注射0.3 ml 1.6％木瓜蛋白酶溶液，1周后重复1次，注射后2周即可见软骨退变、骨质增生。
1.3.3 胶原蛋白酶
Kikuchi等〔20〕将不同剂量的胶原酶（0.5、10，2.0 mg）注入成年兔膝关节腔内，组织炎性反应于注射后1周最重，其后逐渐减轻，至第6周时呈慢性病变后变化较小；注射后2周关节软骨表层缺失、移行层软骨细胞消失并出现裂口；4周时移行区及放射区细胞克隆中度增殖；6周后组织学观察发现关节软骨和滑膜均有变性，与胶原酶剂量呈正相关，外侧股骨髁和胫骨平台处病变较内侧重，移行区及放射区细胞增殖更明显。其关节软骨骨关节炎样改变与人的骨关节炎相似，该方法时间短、药物剂量小，因此该方法在研究骨关节炎病理及抗骨关节炎药物作用时适用。
1.3.4 菲律宾菌素（Filipin）
菲律宾菌素（一种抗生素，提取自在菲律宾发现的微生物）可破坏溶酶体，将其注入兔膝关节腔后可使滑膜增生、基质中蛋白多糖含量降低、关节周缘骨赘产生等〔1〕。
另外，肾上腺皮质激素、透明质酸酶、乙烯亚胺多聚物、单体碘乙酸、软骨碎片或微粒、异物等注入动物膝关节内也可导致关节软骨的退行性改变〔1、8、16〕。
2 自发模型
2.1 C57黑鼠和Hartley豚鼠
Silberberg于1941年首先发现C57黑鼠具有自发形成OA的特性，但C57黑鼠OA模型与人存在一定的差别，主要表现为几乎无关节软骨的微纤维化，关节软骨剥离脱落呈腐蚀状，软骨细胞几无集簇形成，无骨棘形成，滑膜炎症不明显，OA进展过程中不伴有GAG、DNA合成增加。Hartley豚鼠亦有自发OA的特性〔8、21〕，其OA组织学变化随年龄增长逐渐加重。C57黑鼠体积小、不易观察、OA表现与人OA存在一定区别，与之相比，Hartley豚鼠发病率与人OA相似，易于饲养、观察且费用相对较低〔21〕。
2.2 基因缺陷自发OA模型
2.2.1 Ⅱ型前胶原基因缺陷小鼠模型
正常软骨基质胶原以Ⅱ型为主，Ⅱ型前胶原基因点突变使Ⅱ型胶原合成障碍，可导致家族性的OA，呈常染色体显性遗传，并伴有轻度的脊柱软骨发育不良〔10〕。
2.2.2 双糖链蛋白多糖／纤维调节素相关基因缺陷小鼠模型
双糖链蛋白多糖／纤维调节素基因联合缺陷小鼠胶原合成减少，肌腱胶原纤维在结构和机械性能上均发生改变，引起关节不稳定、步态改变、肌腱异位钙化，出现严重早发并快速进展的OA〔10〕。
2.3 基因转录障碍模型
STR／ort小鼠邻近胫骨OA样病损区软骨细胞缺乏胶原Ⅱ、X、Ⅺ和蛋白聚糖（aggrecan）的基因转录，从而使软骨基质合成障碍，在27周龄左右会产生膝关节OA病变，雄性STR／ort小鼠发生比例高且病变较严重。
3 关节软骨细胞体外培养
Ross等〔22〕取正常狗胫骨平台软骨，经过切割、酶解消化、稀释离心冲洗并于特殊的培养液（其组成为DMEM（Dullbecco?s modified Eagle?s medium）、10％牛胎血清、50 μg／ml抗坏血酸盐、100 U／ml青霉素、100 μg／ml链霉素）中培养4周，培养后第1、2 d、第1、2、3、4周分别取样、免疫标记Ⅱ型、Ⅳ型胶原等，在共焦显微镜下观察并与骨关节炎动物关节软骨比较，初步研究结果表明两者病理结构相似，提示培养过程中软骨改变与骨关节炎病程相似，因此可作为研究骨关节炎起病及进展的体外模型。
4 骨关节炎动物模型的选择
自发性OA模型较少受外界因素干扰，可排除操作所致的误差，在研究原发性OA的起始机制、关节软骨生化改变和防治效果的比较等方面具有极大优势，可帮助研究人类骨关节炎众多病理生理改变之间的因果关系，以STP／ort小鼠和Hartley豚鼠模型应用较多。
经由关节外途径制作的模型由于无手术创伤对关节内的影响，适于研究药物疗效及药物对关节软骨成分、炎症介质、蛋白酶等表达的影响和药物的筛选，也适合用于研究步态异常等关节外生物机械因素所致骨关节炎。卵巢切除可作为绝经后骨关节炎模型研究雌激素及其类似物对关节软骨的保护作用。
关节内手术方法如Hulth法等模型诱导成功率高，稳定性好，应用广泛，特别适用于膝关节内注药预防和减轻OA病理改变的研究。但由于手术创伤及炎症易影响OA模型软骨、滑膜的生化代谢，因此不适宜观察OA生化代谢的变化。
关节腔内注射化学物建模所需时间短，可模拟软骨破坏的终末环节，适于软骨病理、药物防治的研究〔10〕，需注意的是不同部位的OA模型所需的药物剂量可能不同。
鼠模型关节软骨退变的组织学特征与人类OA相似，但其关节几何形状与人类稍有不同且软骨不含硫酸角质素，以大鼠或小鼠为OA模型时需考虑上述差异，但用于药物防治软骨退变的研究，鼠模型能满足上述要求；小鼠等小型动物在需要大量使用时具有选择优势。狗、兔膝关节组织结构与人类接近，其OA模型的软骨生化指标与人类OA一致，如研究OA的病理进程、组织病理特征或软骨生化代谢的变化，选用狗、兔模型较适宜〔3、8〕。
关节软骨体外培养可了解骨关节炎病理生理过程，但该方法尚需进一步发现反应骨关节炎的指标，因此目前尚不成熟。
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