大鼠骨骺干细胞的分离鉴定及其永生化细胞株的构建

【摘要】  分离、鉴定大鼠骨骺干细胞并建立永生化的大鼠骨骺干细胞株，为细胞移植和转基因提供稳定的细胞来源。［方法］采用Percoll不连续密度梯度离心法分离骨骺干细胞，利用电穿孔转染技术将含有猿肾病毒40大T抗原基因(SV40Tag)的质粒pCMVSV40T／PUR转染骨骺干细胞，经嘌呤霉素筛选，抗性克隆扩大培养。应用FGFR-3抗体和PCNA抗体进行免疫细胞化学染色，观察细胞的形态及其生长状况并绘制细胞生长曲线。用免疫细胞化学法和RT-PCR检测SV40Tag在转染细胞中的表达。［结果］转染后获得一个阳性细胞克隆，免疫细胞化学结果显示FGFR-3抗体染色阳性。SV40Tag抗体染色和RT-PCR结果显示SV40Tag已稳定转染入骨骺干细胞。转染细胞经扩大培养，命名为永生化骨骺干细胞。［结论］成功纯化大鼠骨骺干细胞并构建了SV40Tag永生化的骨骺干细胞株。

【关键词】  骨骺干细胞 永生化 猿肾病毒40

      Abstract：［Objective］To separate rat precartilaginous stem cells (PCSCs) and establish immortalized precartilaginous stem cell(IPCSC) strain which provides stable cell resource for cell-transplantation and gene therapies.［Method］PCSCs were isolated by discontinuous Percoll gradient centrifugation. The specific marker (anti-FGFR-3)  of  PCSCs  was  used  to  identify  the  cultured  cells  by immunocytochemistry. Plasmids pCMVSV40T/PUR containing the simian virus 40 large T antigen gene (SV40Tag) were transfected into the PCSCs by electroporation method. Colonies were isolated by puromycin selection and amplified to cell strain.The expression of SV40Tag in the amplified cell strain was identified by immunocytochemistry and RT-PCR. Anti-FGFR-3 and anti-PCNA were used to identify the cultured cells after puromycin selection.［Result］One anti-puromycin cell clone was obtained, which was confirmed as FGFR-3 positive PCSCs with the capability of proliferation. The mRNA and protein  expression s of SV40Tag were detected in transfected cells after stable transfection. The transfected cells were amplified to immortalized cell strain maintained for more than 30 passages, named immortalized precartilaginous stem cells(IPCSCs). The population doubling time and anti-PCNA positive confirmed the high capability of proliferation.［Conclusion］Rat precartilaginous stem cells were purifued and immortalized precartilaginous stem cell strain was established successfully. It will provide stable cell resource for the basic researches and cell-transplantation therapies.

    Key words：precartilaginous stem cells;  immortalization;  simian virus 40

    骨骺干细胞(precartilaginous stem cells，PCSCs)是控制生长期动物肢体生长的、能定向分化的成体干细胞[1]，它作为组织工程的种子细胞，可用于软骨与骨缺损的细胞替代治疗[2]。由于PCSCs在第五代左右即开始分化[3]，原代细胞培养技术尚不能在体外获得大量表型一致的PCSCs。建立永生化骨骺干细胞株，将为研究骨骺细胞分化机制以及组织工程提供大量表型、基因型稳定的骨骺干细胞。本研究拟将猿肾病毒40大T抗原基因(SV40Tag)转染至原代培养的大鼠LaCroix环的骨骺干细胞，以期建立永生化骨骺干细胞株，为研究骨骺细胞分化机制以及组织工程提供稳定的细胞来源。

    1  材料与方法

    1.1  主要材料

    1.1.1  实验动物与主要试剂  出生24 h内的SD大鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供；Embryo MaxTM-DMEM干细胞专用培养基、CompleteTM Trypsin Solution购自CHEMICON公司；EGF、bFGF购自Cytolab公司；胎牛血清、青-链霉素购自Gibico公司；Ⅰ型胶原酶购自Sigma公司；兔多克隆抗体FGFR-3(c-15)购自Santa Cruz公司；质粒pCMVSV40T／PUR和大肠杆菌菌株分别获赠于瑞典Jan Holgersson教授和同济田玉科教授；质粒提取试剂盒购自Axygen公司；内切酶NotI和XhoI购至Toyobo公司；Trizol试剂盒购自GIBCO公司；兔抗鼠SV40Tag抗体和兔抗鼠anti-PCNA购自NeoMarkers公司；SP9000免疫组化试剂盒、ZLI29032浓缩型DAB试剂盒和FITC标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉公司。

    1.1.2  引物设计  根据大鼠基因序列设计内参β-actin引物，上游：5'-GTTGACATCCGTAAAGACC-3'，下游：5'-CACCAATCCACACAGAGTA-3'，产物长度为170 bp；根据SV40Tag基因序列设计引物，上游：5'-TATCTTFCAGGT TCAGGG-3'，下游：5'-TGGAATAGTCACCATGAATG-3'，产物长度为558 bp。引物由上海生工公司合成。

    1.2  方法

    1.2.1  PCSCs的分离与鉴定  黄仕龙等的方法，以显微手术器械剪取新生24 h内的SD大鼠股骨下端骺板两侧的La Croix环处的组织[4]，并将其充分剪碎，以CompleteTM Trypsin Solution消化5 min，再以0.1％的Ⅰ型胶原酶37℃消化15～24 h，将细胞按1×106／ml接种于含10 ng／ml bFGF、10ng／ml EGF和0.9％FBS的DMEM培养基中培养。培养48 h后将原代细胞以CompleteTM Trypsin Solution消化，以3 μm单细胞过滤器去除聚集的细胞团成为单细胞悬液，用D-Hank's洗涤后以含0.01％DNA酶的培养基重悬细胞，移至percoll密度梯度液顶层，400 g离心1 h后取第4层细胞以含10 ng／ml bFGF、10 ng／ml EGF和0.9％FBS的DMEM培养基中置于37℃、5％CO2培养箱中培养。第2代骨骺干细胞消化后接种于放有灭菌小玻片的12孔板中，将细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。待细胞长满玻片50％～60％时以4％的多聚甲醛固定30 min，Triton-X100破膜20 min。应用HRP／DAB免疫细胞化学法按照SP试剂盒说明书步骤进行FGFR-3抗体染色，苏木素复染。

    1.2.2  质粒扩增、提取及鉴定      含质粒pCMVSV40T／PUR的大肠杆菌在含有氨苄青霉素25 μg／ml和四环素10 μg／ml的LB培养基中以250 r／min摇菌12～16 h，质粒提取按照质粒提取试剂盒说明进行。获得的质粒以灭菌三蒸水洗脱后置于低温冰箱保存。取每个反应体系1 μg应用Xho I和Not I分别进行单酶切和双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

    1.2.3  电穿孔转染法转染骨骺干细胞      将PCSCs接种于100 ml培养瓶中，调整细胞密度使其在转染当天能收获(2.5～3.0)×105个对数生长期的细胞。用CompleteTM Trypsin Solution消化瓶内细胞。用预冷的PB-蔗糖(272 mmol／L蔗糖，7 mmol／L磷酸钠缓冲液pH 7.4，1 mmol／L MgCl)离心洗涤细胞2次。用20 μl冰PB-蔗糖重新悬浮细胞，加入质粒pCMVSV40T／PUR 1.0 μg，轻轻混匀。移入0.2 mm的电转杯中冰浴5 min。电转参数设置：总电压200V，调幅100％，调频40 kHz，脉冲时间1 ms，脉冲值5，脉冲间隔1 s。电转结束立即加入1 ml含10 ng／ml bFGF、10 ng／ml EGF和0.9％FBS的DMEM培养基，冰浴10 min后，接种于24孔培养板。置37℃、5％CO2培养箱内继续培养。

    1.2.4  转染细胞的筛选、扩大培养及鉴定      细胞转染后24 h，以含0.5 μg／ml 嘌吟霉素的培养基筛选12～14 d，阳性克隆以含0.4 μg／ml嘌呤霉素培养基扩大培养。以转染后的细胞制作细胞爬片，应用免疫细胞化学法进行FGFR-3抗体染色，应用FITC标记的免疫荧光法检测SV40Tag抗体染色。用Trizol试剂盒提取第2代骨骺干细胞和第4、10、30代永生化骨骺干细胞的总RNA，进行逆转录。内参B-actin的PCR反应条件为：94℃预变性5 min，然后进入30个循环：94℃ 1 min，53℃ 50 s，72℃ 50 s，最后再72℃延伸8 min。SV40Tag的PCR反应条件为：94℃预变性5 min，然后进入30个循环：94℃ 1 min，56℃ 50 s，72℃ 50 s，最后再72℃延伸8 min。PCR产物以1.0％琼脂糖凝胶电泳分析。

    1.2.5  绘制细胞生长曲线和群体倍增时间(PDT)  将第2、6、10代骨骺干细胞(PCSC2、PCSC6、PCSC10)及转染后第30代永生化骨骺干细胞按1×102个/孔接种于24孔板，每隔24 h常规消化3孔细胞并计数，绘制生长曲线，按照下列公式计算细胞PDT：PDT=[1g2／(1gN11gN0)]×t，其中N1和N0分别代表接种后和培养t h后的细胞数。统计学处理采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示。不同细胞间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  PCSCs的分离与鉴定  Percoll梯度离心分离得到的骨骺干细胞贴壁生长，折光性好，以梭形或三角形为主(图1)。免疫细胞化学检测可见细胞呈FGFR-3染色阳性，细胞染色部位主要在胞膜(图2)。

    2.2  质粒扩增、提取及鉴定      质粒pCMVSV40T／PUR酶切产物电泳分析(图3)显示质粒载体经Not I或Xho I单酶切各得到一条约5.3 kb的条带；经Not I和Xho I双酶切得到约2.3 kb和3.0 kb的2条带，目的基因约2.3 kb与Genbank中发布的SV40Tag cDNA长度一致。

    2.3  转染细胞的鉴定      转染细胞经筛选培养后获得1个阳性细胞克隆。贴壁培养的细胞形态与原代培养的骨骺干细胞没有明显差别。免疫细胞化学检测显示永生化骨骺干细胞的FGFR-3和PCNA抗体染色阳性(图4、5)，免疫荧光检测显示永生化骨骺干细胞的SV40Tag抗体染色阳性(图6)，RT-PCR结果显示在约560 bp处有一特异形扩增条带，而未转染的原代细胞未见条带(图7)。

    2.4  细胞生长曲线和群体倍增时间  第2、6、10代的骨骺干细胞以及转染后第30代永生化骨骺干细胞生长曲线均呈“S”形(图8)，第10代后骨骺干细胞增殖速度明显变慢停止，细胞出现衰老现象；第30代骨骺干细胞增殖速度明显快于第6、10代骨骺干细胞。永生化骨骺干细胞一般6～7 d传代1次。四者的PDT分别为(29.1±3.1)h，(34.2±3.0)h，(43.5±3.4)h，(28.7±2.9)h，其中PCSC2和第30代IPCSC的PDT明显低于第6、10代骨骺干细胞(P<0.01)。而第30代永生化骨骺干细胞和第2代骨骺干细胞的PDT没有统计学差异(P>0.05)。图1  Percoll梯度离心获得的PCSCs×200  图2  PCSCs的PGFR-3染色，苏木复染×200  图3  质粒pCMVSV40T/PUR酶切产物琼脂糖凝胶电泳分析  ①Marker VI(由下至上依次为250、1 000、2 500、5 000、7 500、1 000 bp);②经双酶切得到约2.3 kb和3.0  kb的2条带；③经Xho I单酶切得到1条约5.3 kb的条带；④经Not  I单酶切得到1条约5.3 kb的条带  图4  第30代IPCSC的FGFR-3抗体染色，苏木素复染×200  图5  第30代IPCSC的PCNA抗体染色×100  图6  第30代IPCSC的SV40抗体染色×100  图7  RT-PCR检测培养细胞SV40Tag mRNA的表达（170 bp处为内参β-actin,560 bp处为SV40Tag）  ①Marker I(由下至上依次为100、200、300、400、500、600 bp);②第2代PCSCs  ③第4代IPCSC  ④第10代IPCSC  ⑤第30代IPCSC  图8  PCSCs和IPCSC的生长曲线

    3  讨  论

    1999年Robinson等人分离出骨骺干细胞[1]，为研究骨骺发育问题提供了新的思路，同时也为组织工程找到一种所需要的种子细胞。目前骨骺干细胞的研究已成为骨科领域的一个新热点。近年来游洪波等对骨骺干细胞进行了纯化[5]，为研究骨骺干细胞向软骨细胞分化、更深入地进行软骨组织工程的研究奠定了基础。但骨骺干细胞的研究还有许多的难题等待作者去解决。首先，由于骨骺干细胞在第5代左右即开始分化[3]，原代细胞培养技术尚不能在体外获得大量表型一致的骨骺干细胞。细胞的增殖一直是一个瓶颈问题，如何获得组织工程所需要的种子细胞的数量，国内外尚未有很好的解决方案。其次，要明确使细胞向软骨及骨细胞分化的基因和环境信号、如何控制骨骺干细胞向软骨细胞分化，都需要进一步深入研究。

    猿肾细胞病毒SV40由结构蛋白(VP1、VP2、VP3)和2种抗原(大T抗原和小T抗原)组成［6］。大T抗原为细胞转化启动所必需，对转化起决定作用，而且转化细胞表型的维持必须依赖大T抗原的持续表达[7]。SV40Tag是目前较为常用且有效的体外永生化细胞的基因片段之一，可通过与生长抑制因子pRB、p53和SEN6相互作用，避免细胞进人凋亡，延长细胞寿命，并使细胞最终度过危机期，实现永生化[8]。本实验利用电穿孔转染技术将含有SV40Tag的质粒转染体外培养的大鼠PCSC。RT-PCR及免疫荧光检测SV40Tag抗体证实SV40Tag已稳定转导入骨骺干细胞中，并在基因和蛋白水平均有表达。转染后细胞形态与原代骨骺干细胞无明显区别，以多角形和短梭形为主，一般5～6 d传代1次。同时转染后细胞的免疫细胞化学FGFR-3抗体和PCNA抗体染色均为阳性，证实细胞在转染后仍具有骨骺干细胞的基本特性。该细胞株目前已传到了第30代，尚未观察到明显的分化现象。这些结果说明SV40Tag能成功地介导体外培养骨骺干细胞的永生化。

    本研究成功地构建了SV40Tag永生化的大鼠骨骺干细胞株，为研究骨骺细胞分化机制以及组织工程提供稳定的细胞来源。

【】
  ［1］ Robinson D，Hasharoni A，CohenN，et al.Fibroblast growth factor receptor-3 as a marker for precartilaginous stem cells[J].Clin Orthop，1999，(367)：163-175．

［2］ 游洪波，陈安民.藻酸盐水凝胶与前软骨干细胞构建组织化工程骺板［J］.生物骨科材料与临床研究，2004，1(7)：1-5．

［3］ 张衣北，陈安民，郭风劲.骨骺干细胞的体外培养以及生长特性观察［J］.康复杂志，2006，2(1)：79-82．

［4］ 黄仕龙，陈安民，郭风劲，等.鼠骨骺增殖区细胞的的分离鉴定和克隆构建PTHrP基因真核表达载体[J].中国矫形外科杂志，2005，13(19)：1489-1491．

［5］ 游洪波，陈安民，程浩.免疫磁性细胞分选技术分离纯化新生大鼠骨骺前软骨干细胞[J].中华创伤杂志，2004，20(10)：606-608．

［6］ Nakanishi A，Nakamura A，Liddington R，et al．Identification of amino acid residues within simian vires 40 capsid proteins Vp1，Vp2，and Vp3 that are required for their interaction and for viral infection[J]．J Virol,2006,80(18)：8891-8898．

［7］ May T，Wirth D，Hauser H，et al．Transcriptionally regulated immortalization overcomes side effects of temperature-sensitive SV40 large T antigen[J]．Biochem Biophys Res Commun,2005,327(3)：734-741．