hTERT激活人骨髓间充质干细胞端粒酶活性

【摘要】  明确外源性人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)能否激活人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchyme stem cell，hBMSC)的端粒酶活性。［方法］培养人骨髓间充质干细胞，采用脂质体转染法，将编码hTERT基因的真核表达质粒pCIneo?hTERT导入单克隆培养的人骨髓间充质干细胞。利用G418加压筛选，稳定后，用RT?PCR检测hTERT mRNA的表达，Western Blot检测其蛋白质表达，专用检测盒RT?PCR法检测端粒酶的活性。［结果］骨髓间充质干细胞转染质粒pCIneo?hTERT后，生长状态良好。加G418后第2 d，细胞开始悬浮，逐渐死亡。第10 d，未转染组细胞在G418作用下全部死亡，转染组细胞开始克隆增殖。G418浓度降至100 μg／ml维持筛选，20 d左右开始出现明显抗G418细胞克隆。转染后细胞，表达hTERT的mRNA及其蛋白，同时端粒酶活性显著增高。［结论］将外源性hTERT导入人骨髓间充质干细胞可以激活细胞的端粒酶活性，为建立永生化细胞系奠定了基础。

【关键词】  人端粒酶逆转录酶 端粒酶 人骨髓间充质干细胞 基因

    Abstract：［Objective］To explicate whether the telomerase activity is regulated by human telomerase reverse transcriptase (hTERT) in human bone marrow mesenchyme stem cells(hBMSC).［Method］hBMSC were cultured and transfected with eukaryotic expressing plasmid pCIneo?hTERT encoding hTERT. After selection with G418 to stabilize the transfection,expression of hTERT mRNA was detected with TR?PCR, detecting the expression of hTERT protein was detected with Western Bolt, and the telomerase activity in untransfected and transfected cells were detected by RT?PCR.［Result］The hMSCs grew well after transfecting plasmid pCIneo?hTERT.The cells began to suspend and die after the day of the G418 selection. At the tenth day,all the untransfected cells were dead, but the transfected cells began to clone proliferation. So the density of G418 subdued to 100 μg/ml for maintaining selecting, at the twentieth day,there were obvious anti?G418 cell clones. After stable transfection, hTERT was expressed at mRNA and protein level in these anti?418 cell clones, and meanwhile telomerase activity was positive and obviously raise up in these transfected cells.［Conclusion］In human' bone marrow mesenchyme cells,telomerase could be activated by exogenous hTERT. This is a foundation to establish immortalized human bone marrow mesenchyme stem cell line.

    Key words：hTERT;  telomerase;  human bone marrow mesenchyme stem cell;  gene

   髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchyme stem cell，hBMSC)目前作为组织工程的种子细胞，在基础研究与临床中得到广泛应用。但是也存在许多问题［1～3］，在基础研究中存在如何得到纯化，甚至标准的细胞系，使各实验室之间以及实验室前后研究之间具有可比性和延续性的问题；在临床生物工程应用中存在细胞老化、去分化，以及生物工程化器官过程中，如何获得足够数量的种子细胞的问题［3］。

    细胞培养广泛应用于基础研究、临床实践和生物工程［4］。然而，正常组织来源的细胞在通常的体外培养条件下经过有限次的传代后，就会停止分裂增殖，发生衰老和死亡［5］，这就限制了细胞培养技术的进一步应用。因此，学者们提出建立永生化细胞系，使体外培养的细胞具有无限增殖能力。

    研究表明，端粒酶的激活可以延缓细胞的衰老，甚至使细胞永生化［6,7］。TERT作为端粒酶的逆转录酶，与细胞端粒酶的活性高低密切相关［8］。本实验将外源性人TERT(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因转染至克隆培养的hBMSC中，以明确hTERT能否调控其端粒酶活性，为建立永生化人骨髓间充质干细胞系奠定基础。

    1  材料和方法

    1.1  主要试剂与材料

    L?DMEM低糖培养基，胰酶，限制性内切酶EcoRI、SalI，Midi质粒纯化试剂盒，G418：均为美国Gibco BRL公司产品；胎牛血清为美国Hyclone公司产品；LipofectAMINE 2000转染试剂盒：美国Invitrogen公司；端粒酶活性检测试剂盒：华美生物工程公司；质粒pCIneo?hTERT(hTERT基因克隆至真核表达载体pCIneo，酶切位点EcoRI和SalI)美国学者Weinberg RA惠赠。

    1.2  方法

    1.2.1  质粒DNA的转化、扩增、纯化和鉴定  挑取生长良好的大肠杆菌DH5α单菌落制备为感受态细胞，取50 μl感受态细胞，加2 μl质粒pCIneo?hTERT溶液进行细菌转化，过夜后挑取单菌落，接种于含氨苄青霉素的LB培养液进行质粒的扩增，按试剂盒说明书提取并纯化质粒。核酸蛋白分析仪进行浓度和纯度的测定后，取10 μl质粒以EcoRI和SalI双酶切(各0.5 μl)，1％琼脂糖电泳进行鉴定，其余置-20°保存待用。

    1.2.2  细菌培养和基因转染  原代单克隆培养的人骨髓间充质干细胞［9］接种于24孔板，每孔约2×105个细胞，待细胞长到90％时，按LipofectAMINE 2000转染试剂盒说明书进行pCIneo?hTERT的转染。24 h后1∶10传代，次日加G418，浓度为200 μg／ml。经过9～10 d，未转染组细胞在G418作用下全部死亡，此时将G418浓度降为100 μg／ml，继续培养，20 d左右出现明显细胞抗性克隆。在显微镜下用含胰酶的10 μl移液枪转移至24孔板扩大培养。取转染前及转染后第10、25代细胞进行以下实验。

    1.2.3  hTERT mRNA的表达  用Trizol裂解沉淀细胞后，提取总mRNA。根据hTERT的mRNA序列(Gene Bank)和［10,11］，  设计PCR扩增的两条引物：上游5'-GACACACATTCCACAGGTCG-3’和下游5'-GACTCGACACCGTGTCACCTAC-3'，预期产物片段为175 bp。采用Titan TM One Tube RT-PCR Kit进行RT-PCR检测hTERT mRNA的表达。RT-PCR参数为：50° 30 min；94° 10 s，60° 30 s，68° 45 s，10个循环；94° 10 s,60° 30 s，68° 2 min，25个循环；68°，7 min。

    1.2.4  hTERT蛋白的表达  参照文献［12,13］，以三去污剂裂解液裂解细胞，提取细胞内总蛋白，经核酸蛋白分析仪定量后，每孔上样量为50 μg，进行hTERT的Western Blot分析。采用Western Blotting Luminol Reagent测试剂盒显色。同时，取细胞爬片，多聚甲醛固定后，按说明书进行细胞免疫组织化学染色，免疫荧光显色。

    1.2.5  端粒酶活性的检测  按端粒酶活性检测试剂盒说明书操作。收集2×106个细胞，洗涤离心后裂解，冰浴30 min，离心后上清即含细胞端粒酶。取2 μl进行RT?PCR扩增端粒酶重复序列。扩增产物经杂交反应后显色，测定波长450 nm处的吸光度A值，反映细胞端粒酶活性。其中阳性对照：人胚肾转化细胞系293细胞；阴性对照：65°处理293细胞30 min。阴性对照A值低于0.05时按0.05，高于0.05时按实际值计算，样本大于阴性对照A值的3倍时，判为端粒酶活性阳性。

    2  结  果

    2.1  质粒扩增和酶切鉴定

    质粒pCIneo?hTERT经试剂盒提取纯化后，核酸蛋白分析仪分析表明：A260／A280和A260／A230的比值分别为1.80和2.12，说明提纯质粒好，基本无蛋白、RNA及酚的污染，可用于基因转染；浓度为0.55 μg／ μl。采用EcoRI和SalI双酶切后电泳如图1所示，酶切片段与预期大小一致，表明质粒无误。

    图1  pCIneo?hTERT酶切鉴定(M:2kb Marker,D：酶切，P:质粒)

    2.2  细胞培养和基因转染

    细胞转染质粒pCIneo?hTERT后，生长状态良好。加G418后第2 d，细胞开始悬浮，逐渐死亡。第10 d，未转染组细胞在G418作用下全部死亡，转染组细胞开始克隆增殖。G418浓度降至100 μg／ml维持筛选，20 d左右开始出现明显抗G418细胞克隆(图2)，用移液枪转移，扩大培养。

    图2  转染后BMSCs的G418抗性克隆形成17 d观察

    2.3  hTERT mRNA的表达

    转染后第10、25代细胞的总RNA经RT?PCR后可获得约175 bp的特异性片段，表明细胞在mRNA水平上表达hTERT(图3)。

    2.4  hTERT蛋白的表达

    Western Blot检测结果显示转染细胞在124 ku左右见特异性条带，为hTERT蛋白，转染前细胞未能检测到该蛋白(图4)。

    细胞免疫组织化学染色显示hTERT蛋白定位于细胞核(图5)。

    图3  RT?PCR分析hTERT mRNA表达，获175bp特异片段(P10，P25转染传代细胞；C：对照原代细胞)  图4  Western Blot分析hTERT蛋白的表达(P10，P25转染传代细胞，C：对照原代细胞)  图5  hTERT蛋白的表达，免疫细胞化学染色，免疫荧光×200

    2.5  端粒酶活性

    端粒酶检测结果，图6表明原代BMSC仍然存在一定端粒酶活性，但是活性较低。转染后BMSCs端粒酶活性转为阳性，并且持续保持阳性表达，其活性可达到人胚肾细胞系的水平。

    图6  端粒酶活性比较

    3  讨  论

    端粒是真核细胞染色体末端富含G的DNA重复序列，由DNA及其相关蛋白组成，虽不含基因，但是在稳定染色体方面具有重要作用［14,15］。端粒酶是一种能延长端粒末端的核酸蛋白酶，由蛋白质和RNA组成，可以以其自身的内源性RNA为模板，发挥RNA指导的DNA合成作用，向端粒末端添加(TTAGGG)n序列，使端粒延长，从而延长细胞的寿命。正常情况下，除了一些生殖细胞和胚胎干细胞表达端粒酶活性以外，其他体细胞都不表达端粒酶活性［6］。现在已经明确人端粒酶由3个部分组成［17］:(1)端粒酶自身的RNA模板：端粒酶以自身RNA为模板，以端粒的3'-overhang为引物，在端粒的末端加上新的重复序列，使端粒延长。在多种人体正常组织中均有人端粒酶RNA的表达；（2)人端粒酶逆转录酶(hTERT)：是端粒酶的活性部位。Meyerson等［18］克隆出人的编码端粒酶催化亚基的cDNA，hTERT mRNA在大多数缺乏端粒酶活性的正常体细胞中不能检测到；（3)端粒酶的相关蛋白：TP1／TLP1基因编码端粒酶的相关蛋白，和端粒酶的活性没有必然的联系，具体功能尚不清楚。上述3个组成部分中hTERT是恢复端粒酶活性的关键。然而，有学者发现hTERTmRNA在组织分布上与端粒酶活性并不完全一致［19］，而且端粒酶的组成和结构至今尚未完全明确。另外，端粒酶活性受到复杂机制的调节，在不同层次上存在各种调节因素，如端粒长度变化、端粒酶RNA和蛋白组分、癌基因和抑癌基因、细胞分化和细胞周期等。所以，目前还不能断定hTERT与端粒酶激活的必然联系，即并不是每一种细胞转染hTERT基因均可激活该细胞的端粒酶活性。

    为了明确在人骨髓间充质干细胞中导入外源性hTERT能否调控端粒酶活性，作者克隆培养hBMSC［9］，导入克隆至真核表达载体pCIneo的hTERT基因。G418筛选20d后形成抗性细胞克隆，移液枪转移，扩大培养，细胞端粒酶活性转为阳性。因此，作者认为在hBMSC中，导入外源性hTERT可以激活端粒酶，其活性可达到人胚肾细胞系的水平。

    目前，有关端粒和端粒酶的研究主要集中在肿瘤的基因上［20］，抑制端粒酶活性，促进肿瘤细胞凋亡。借用这一思路，反之，构建hTERT真核表达质粒转染体外培养的细胞，使细胞在体外培养的生命期延长，用于构建组织工程化标准种子细胞系，可能是解决体外培养细胞增殖困难、传代时间短、细胞衰老的方法之一，且hTERT真核表达质粒较病毒载体的安全性更高。以往研究结果表明［10,11］，将编码hTERT的基因转染到正常人成纤维细胞和血管内皮细胞，可以使正常人体细胞突破“Hayfliek极限”，细胞寿命得以延长，细胞可在体外长期传代，无致瘤性，细胞仍保持正常的形态和功能。

    实验表明，用脂质体法将构建的hTERT真核表达质粒pCIneo?hTERT体外转染人骨髓间充质干细胞，转染后的细胞端粒酶活性明显提高，为进一步建立人骨髓间充质干细胞标准细胞系奠定了基础。

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