组织培养法在关节软骨保存中的应用
作者：宋洪强，亓建洪，玄燕华，毕研花
【摘要】 ［目的］探讨3种保存方法对关节软骨细胞活性的不同影响，寻求效果优良的软骨组织保存方法。［方法］切取成年猪骨软骨，制成约4.5 mm×5 mm大小的圆柱形骨软骨块。采用组织培养法、慢速梯度降温冷冻法、传统慢速连续降温冷冻法对软骨块进行保存处理，观察并比较保存后软骨细胞活性的变化。［结果］保存8周时，采用传统冷冻法的关节软骨细胞存活率不足50％，软骨基质成分大量丢失；采用慢速梯度降温冷冻法的细胞存活率66％，而使用组织培养法保存的关节软骨细胞存活率高达76%以上，软骨基质成分仅少量丢失。［结论］3种方法相比较，组织培养法可以长期保存关节软骨组织活性，是更为理想的软骨组织保存方法。
【关键词】 关节软骨； 保存； 组织培养； 活性
Abstract：［Objective］To study the effects of different storage method on the viability of cheodroeytes so as to find out the idem method for preservation of articular cartilage.［Method］Under the aseptic condition,acquiring 240 pieces of osteoehondral plugs from both condyles of femur and tibial plateau.The control group was not treatment using any preserved means.The tissue?cultured group was to used F12?DMEM medium long?term preserved osteochondral plugs under the conditions of 37 ℃.At preserve 8 weeks,takes the osteochondral section to carry on examination observation ohondrocytes Viability activeness change separately.［Result］The control group chnadrocyte survival rate was 94.4%.At preserves 8 weeks,the cell survival rate of the tissue?cultured group was 76%,the grading?cooling cryopreservation group was 66%,the constant?cooling cryopreservation group only was 41.80%.［Conclusion］Under the condition of 37 ℃,tissue culture method can long term preservation of vital articular cartilage in vitro.The chondrocyte survival rate of the preservation of vital articular cartilage in vitro.The chondrocyte survival rate of the tissue?cultured method obvious higher than constant?cooling cryopreservation method.
Key words：articular cartilage; preservation; tissue?cultured; viability
异体骨软骨移植物的保存尚无理想的方法，这明显制约了异体软骨移植的临床应用，如何保存软骨组织的活性，对于保证移植的成功至关重要。因此，作者进行了以下实验，希望找到更为理想的软骨组织保存方法。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
F12-DMEM培养基，购于美国Sigma公司；程序降温仪器：国产RBL?PA?Ⅰ型程序冷冻仪；冷冻保存仪器：SANYO-80 ℃深低温冰箱。
1.2 实验动物
取清洁级健康成年长枫白猪10只20膝，无菌条件下在髌股关节及胫股关节切取正常骨软骨，制成直径约4.5 mm、长约5 mm的圆柱形骨软骨块240枚。将骨软骨块随机分为4组，每组60枚。备用。
1.3 实验方法
将骨软骨块随机分为4组，每组60枚。分别为：
对照组：即新鲜软骨标本不采取任何处理措施，取材半小时内即行组织化学、免疫组织化学观察和软骨细胞培养MTT比色法测定存活率。
实验组包括：
组织培养组（A组）：将取材的骨软骨块按体积比1∶15放入配制的普通无菌F12?DMEM混合培养液（含有100 U／ml的青链霉素，pH值7.2～7.4）中，放入37 ℃ CO2培养箱保存，隔日换液1次。
慢速梯度降温冷冻组（B组）：将骨软骨块浸泡于4 ℃无菌含有15％DMSO的玻璃化保护液中浸泡2 h，然后3层无菌血浆袋包装后进行降温。先以-1 ℃／min的速率从室温降温至-4 ℃，维持30 min，然后以-1 ℃／min的速度降温至-10 ℃并维持30 min，进而以-1 ℃／min的速度降温至-20 ℃，维持30 min，再连续降温至-40 ℃，维持30 min，最后放入-80 ℃深低温冰箱中保存。
慢速连续降温冷冻组（C组）：采取〔1〕报道的传统方法，将骨软骨块先在4 ℃无菌10％ DMSO中浸泡1 h，然后3层无菌血浆袋包装后进行降温。首先以-1 ℃／min的速率连续降温至-40 ℃，再投入-80 ℃深低温冰箱保存。
保存后处理：实验组于保存8周时分别取软骨块进行指标检测，冷冻2组软骨块自冰箱取出后，立即行37 ℃水浴复温（复温速率约100 ℃／min）10 s，将标本从包装袋取出依次投入10％、5％的蔗糖溶液（37 ℃）中各停留5 min（洗除融解的冻存液，防止冷冻保护剂对软骨细胞产生毒性），最后移至PBS液冲洗3遍。组织液培养组从培养液中取出标本，立即在无菌PBS缓冲液中漂洗3遍，清洗掉残存的培养液。
1.4 实验指标检测：
1.4.1 软骨细胞代谢活性检测
取20枚标本4％多聚甲醛固定36 h，冲洗，10%EDTA脱钙2周，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，石蜡切片，行甲苯胺蓝染色观察软骨基质蛋白多糖含量的变化、Collagen Ⅱ免疫荧光化学染色观察软骨基质中Collagen Ⅱ的变化。
1.4.2 软骨细胞存活率检测（MTT比色法）
将其他40枚标本取出后，不经固定处理，切取骨软骨块的软骨层，不带有软骨下骨等其他组织，称重后（每组均称取1g）将软骨切成约1 mm×1 mm×1 mm大小的碎块，移入20 ml的离心管，按三步酶消化分离〔2〕进行组织消化。原代软骨细胞的收获及计数：将组织消化液经200目滤网过滤入100 ml烧杯中，以DMEM HamF12培养液稀释，分装入50 ml离心管，2 000 r／min离心10 min，弃上清。加入适量培养液简单吹打漂洗后，1 500 r／min离心，5 min，弃上清，重复1次后，加入含体积分数为10％FCS的基础培养液，吹打为均匀的单细胞悬液，取样3次，以细胞计数板计数，平均值及细胞收获的总数，软骨细胞原代及传代培养：取所需量的原代软骨细胞悬液，以3×104个细胞／cm2的密度、含体积分数为10％FCS的基础培养液接种于24孔培养板，置于37 ℃、体积分数为5％CO2培养箱内。接种48 h后首次换液，以后隔天换液。当细胞生长至80％～90％融合时，在24孔培养板的6孔中加入0.15 ml MTT溶液，继续培养4 h。吸取培养液，加入15 ml DMSO，振荡10 min，使结晶充分溶解。在酶标仪上测定光吸收值（OD值表1～4），测定波长为490 nm，以只加培养液的6孔作为空白对照。细胞存活率=试验组光吸收值／对照组光吸收值×100％。
1.5 统计学分析
所有数据均用x-±s表示，采用SPSS 12.0统计分析软件进行统计处理，对各组的细胞存活率计量数据资料采用单因素方差分析q检验，P＜0.05表示具有显著统计学意义。
2 结 果
2.1 软骨细胞代谢活性的观察
2.1.1 甲苯胺蓝染色结果
对照组可见，正常关节软骨细胞分散在蓝色背景下，甲苯胺蓝着色在软骨深层组织较深，在软骨浅中层组织颜色较淡，整体软骨基质异染性明显（图1a）。组织保存8周时可见，A组基质异染性较好，甲苯胺蓝染色轻度减退（图1b），B组基质异染性较差，着色中度减退（图1c）；C组基质异染性差，组织着色明显减退（图1d）。
2.1.2 Ⅱ型胶原免疫荧光染色结果
对照组可见，SABC?CY3免疫荧光法标记关节软骨中的Collagen Ⅱ，阳性颗粒呈鲜红色，定位于软骨基质，大致排列呈“拱形结构”（图2a）。组织保存8周时可见，A组Collagen Ⅱ表达的荧光强度轻度降低（图2b）；B组中度降低（图2c）；C组重度降低，提示基质中Collagen Ⅱ大量丢失（图2d）。
2.2 软骨细胞存活率的观察
MTT比色法测定软骨细胞存活率，在酶标仪上测定光吸收值（OD值）（表1～4），细胞存活率=试验组OD值／对照组OD值×100％。表1 新鲜组OD值表2 组织培养组OD值表3 慢速梯度降温冷冻组OD值表4 慢速连续降温冷冻组OD值
3 讨 论
关节软骨缺损的修复问题已经困扰人们很多年，同种异体骨软骨移植对局限性软骨缺损替代修复是一个很好的方法。张海宁等〔3〕研究证实：同种软骨移植能以类似透明软骨的结局修复关节软骨缺损，软骨细胞生物学特性类似于正常关节软骨细胞，并且移植的近期效果优于软骨下骨钻孔术。但是，软骨保存尚无理想的方法，这明显制约了同种异体软骨移植技术的。Schachar报道〔4〕同种异体软骨移植远期效果不理想可能与以下原因有关：（1）软骨细胞存活率多大才足以维持软骨基质的完整性目前尚无定论，但传统冷冻保存的软骨细胞约50%的存活率太低；（2）存活软骨细胞的代谢活性下降，不能合成足够的基质；（3）冷冻保存损伤了软骨基质的完整性，而存活的软骨不能进行修复。如何保存软骨组织的活性，对于保证移植的成功至关重要。既往保存软骨的方法常用的有：化学保存方法如用甲醛、酒精、硫柳汞等保存的软骨均会导致软骨失去活性，此种无活性的软骨移植物因其易变性、吸收及排斥反应大等缺点，从而使其应用大为受限。
近年，随着低温医学的发展，冷冻方法成为目前最常用的软骨保存方法之一。伴随着冷冻参数、低温保护剂、冷冻程序等方面的不断改进，此方法取得了很大进步。但是，随之发现其双面性，在保存软骨活性的同时造成软骨细胞的巨大伤害。迄今为止，有关冷冻保存软骨活性的方法，细胞存活率均很低。近年有实验研究报道〔5〕，羊软骨冷冻保存60 d，软骨细胞存活率仅为51.6％。在本实验中，采用传统冷冻保存方法保存猪软骨组织8周，细胞存活率不足50％，这与报道结果有一致性。本研究认为：软骨基质中含有大量水分，可导致冷冻过程中产生大量的冰晶，明显损伤细胞活性；软骨基质的屏障作用，可以减少冷冻防护剂向细胞内渗透的数量，明显减弱其保护作用。因此，对同种异体骨软骨移植物保存的传统方法的改进或者新方法的发明是非常必要的，这对于促进同种异体骨软骨移植技术的发展具有极为重要的意义。
组织培养技术是一门在体外模拟体内生长条件的基础上建立的“活体”实验技术。近年来有学者尝试用组织培养法保存游离软骨细胞和皮肤移植片并取得成功。Malinin等〔6〕研究认为，在低温条件下（4 ℃～6 ℃），用组织培养法保存软骨块时间不宜超过21 d，否则软骨细胞存活率会发生时间依从性下降并出现软骨退变现象。因此，在本实验中，选用37 ℃条件，使用普通F12?DMEM混合培养液保存关节软骨，所用的培养条件近似于体内环境，可以避免低温损伤，在8周的保存期内，未发现软骨基质包绕现象，软骨细胞存活率高达75％以上，与传统冷冻保存方法比较有极显著统计学差异，这一结果令人振奋。实验结果证明本方法有利于软骨长期存活而且对软骨基质成分影响小，方法可靠，，简便易行。F12?DMEM培养液中含有软骨细胞所必需的营养成分，与其他培养基相比，还含有微量元素和无机离子，营养丰富，可以不使用血清，就能够提供软骨细胞生长所必需的营养物质，满足细胞存活的需要，能长期维持软骨细胞活性。而且，在本实验采用37 ℃条件组织培养法，避免了冷冻保存方法对离体软骨组织造成的巨大冻伤，较好地保护组织活性，因此是更为理想的保存方法。
【文献】
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