BMP?2活性多肽体外定向诱导大鼠BMSCs 向成骨方向分化的实验研究
【摘要】 骨形成蛋白?2（BMP?2）具有较强的诱导大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨方向定向分化的能力。天然的BMP?2数量有限，结构复杂，限制了其广泛应用。本实验设计合成了BMP?2活性多肽，体外试验探讨其对BMSCs向成骨方向定向诱导成骨分化的能力，评价BMP?2活性多肽的诱导成骨效应。［方法］实验分2组，诱导组和非诱导组。取4周的Wistar大鼠分离培养BMSCs，传至第3代时，实验组，改用成骨诱导培养基（DMEM完全培养基+BMP?2活性多肽200 μg／ml）。非诱导组，仍采用DMEM完全培养基。继续培养2~4周，采用细胞爬片培养、碱性磷酸酶活性和钙含量测定、实时定量PCR检测Ⅰ型胶原（Col?Ⅰ）及骨桥蛋白（OPN）mRNA的表达，评价BMP?2活性多肽的体外诱导成骨能力。［结果］诱导组BMSCs生长良好，表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性，ALP活性上升，钙含量增加，Col?Ⅰ和OPN的mRNA呈高表达。非诱导组，成骨特性不明显。［结论］合成的BMP?2活性多肽能有效地促进BMSCs向成骨方向分化，是组织工程化骨中理想的诱导成骨的细胞因子。具有与天然BMP?2类似的骨诱导活性，具有广阔的应用前景。
【关键词】 BMP?2活性多肽 骨髓间充质干细胞 导成骨
Abstract：［Objective］To investigate the capability of synthesis BMP?2?derived peptide on osteogenic induction in bone marrow stem cells(BMSEs),and to evaluate the osteoinductivity of BMP?2?derived peptide in vitro.［Method］After segregating and cultivating four weeks Wistar rats marrow stromal cells in induction group were induced by osteogenasis medium containing 200 gg/ml BMP?2?derived peptide,and in non?inductional group BMSCs were still culture with DMEM medium.Following continue culture for 2~4 weeks,cells film preparation,alkaline phosphatase activity and calcium deposition were measured.Type I collagen（CoM）and osteopontin（OPN）mRNA expression were measured using real?time fluorescent quantitative polymerase chain reaction（FQ?PCR）technique.The capability of synthesis BMP?2?derived peptide on osteogenic induction of BMSCs was investigated.［Result］After inductived with BMP?2?derived peptide.BMSCs cultured survived well greatly changed in cell morphology,and showed a biological and morphologie characteristics similar to those of osteoblasts.The lever of alkaline phosphatase activity and calcium deposition increased.Col?Ⅰand OPN mRNA were expressed at higher level.In non?inductional group no conspicuous osteogenic induction was shown.［Conclusion］BMP?2?derived peptide can induce BMSCs to differentiate into osteoblasts.It has the similar capacity of osteogenic induction as nature BMP?2,so BMP?2?derived peptide is an ideal cell agent for bone tissue engineering,and can be available widely.
Key words:BMP?2?derived peptide; BMSCs; osteoinductivity
骨髓基质细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）具有多向分化潜能，在一定细胞因子作用下可向成骨细胞方向分化，目前已成为骨组织工程理想的种子细胞〔1〕。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMP）属于TGF?β超家族成员，是一种多功能的生长因子，其中BMP?2是最主要的骨形成调控因子〔2、3〕。天然BMP?2数量有限，且生物活性难以发挥〔4、5〕。本实验根据BMP?2的核心功能区氨基酸序列，固相合成法合成一条含24个核苷酸的短肽——BMP?2活性多肽，体外诱导大鼠的BMSCs向成骨方向定向分化，评价其诱导效能。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
倒置相差显微镜（Axiovert35，Zeiss Corp，Germany）；低糖DMEM培养基（Cibco）；胎牛血清（Cibco）；胰蛋白酶（Sigma）；碱性磷酸酶（ALP）活性试剂盒（南京间建成生物工程有限公司）；细胞钙含量试剂盒（Sigma公司）；BMP?2活性多肽（本课题组与吉尔生化上海有限公司联合研制）。
1.2 BMSCs分离和培养
取4周龄健康Wistar大白鼠2只，由同济医学院动物实验中心提供，体重约120 g，雌雄不限，10％水合氯醛腹腔注射麻醉，双侧下肢剪毛，75％酒精浸泡消毒30 min（将大白鼠头露于外面），无菌条件下取出双侧胫骨和股骨，剪除骨端，10号注射器抽取1 ml DMEM完全培养基（含20％小牛血清，100 mg／ml青霉素，100 mg／ml链霉素）自一端冲洗，制成单细胞悬液，以3×104／ml细胞数接种至100 ml培养瓶中，置于37 ℃、5％CO2及饱和湿度孵育箱中，24 h后全量换液，以后每3 d换液1次。待细胞汇合成单层后，用0.25％胰蛋白酶进行1∶3消化传代。
1.3 BMSCs的成骨诱导培养
取体外扩增的第3传代细胞，以1×105个／cm2的种植密度接种到预置盖玻片的6孔培养板中传代培养。将传代细胞分为2组，诱导组：培养24 h后，改用成骨培养基（DMEM完全培养基+BMP?2活性多肽200 μg／ml）。非诱导组：仍采用DMEM完全培养基。2组细胞持续培养，常规3~4 d换液1次，进行细胞形态学观察及生物学特性检测。
1.4 细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性和钙含量检测
成骨诱导培养基培养5、10、15及20 d时，将6孔板中的细胞用PBS洗2次，0.25%胰酶消化5～8 min，每孔加入培养基1 ml终止消化，4 ℃ 10 000r/min离心5 min，再用PBS洗3次，加细胞裂解液破膜。按试剂盒进行ALP活性检测。于520 nm波长处测定吸光度（A值）。钙含量：培养皿用PBS洗2遍，加入1 ml 0.5mol/L HCl，振荡过夜，次日10 000r/min离心5 min，上清液用钙试剂盒（Sigma公司）测定钙含量。每份上清液取20 L，以等量无离子水为空白对照，按试剂盒说明进行操作，于575 nm波长处测A值。
1.5 实时荧光定量RT?PCR检测Col?Ⅰ和OPN mRNA的表达
1.5.1 引物设计
在NCBI上搜索到大鼠Col?Ⅰ和OPN基因，找到该基因的mRNA,结合使用Primer 5设计引物，由上海博亚生物技术有限公司合成引物。
Col?Ⅰ引物序列：
Forward primer：5′?CAGACGGGAGTTTCTCCTCGGACGT?3′；
Reverse primer：5′?GACCAGGAGGACCAGGAAGTCCACGT?3′；
OPN引物序列：
Forward primer：5′?TGGTTTGCCTTTGCCTGTTCG?3′；
Reverse primer：5′?ATGGCTTTCATTGGAGTTGCTTG?3′；
β?actin引物序列：
Forward primer：5′?AGCAGAGAATGGAAAGTCAAA?3′，
Reverse primer：5′?ATGCTGCTTACATGTCTCGAT?3′。
1.5.2 大鼠BMSCs的接种处理及细胞收集
将生长良好的第3代BMSCs以1×105个／cm2的密度接种预置盖玻片的6孔培养板中，BMP?2活性多肽诱导组培养24 h后改用成骨诱导培养基。非诱导组仍采用DMEM完全培养液；在第14 d时通过胰酶消化法收集细胞。每组各取3孔FQ?PCR复测。
1.5.3 实时荧光定量PCR反应（FQ?PCR）
实验按Trizol试剂说明书进行。SYBR Green I荧光染料（购自美国Biotium公司）。PCR反应条件：94 ℃ 30 min，53 ℃ 30 min，72 ℃ 30 min，50个循环。
1.5.4 统计处理
应用SYBR Green Ⅰ荧光染料技术行实时定量PCR反应，获取各组标本的标准曲线，机分析Ct值。
2 结 果
2.1 BMSCs的形态学改变
倒置相差显微镜下观察，BMSCs细胞呈圆形或椭圆形，分离培养12 h开始贴壁，呈圆形或椭圆形。3 d细胞增殖，数量增多，呈梭形或多角形。5～7 d，细胞数量明显增多，呈单层生长。可长满瓶底。诱导组用含BMP?2活性多肽200 μg／ml的成骨性诱导培养基3～4 d后，培养细胞发生明显的形态变化，由梭形转变为肥硕梭形或多角形。
2.2 ALP活性及钙含量测定
2组分别于培养5、10、15及20 d时收集细胞，按试剂盒说明书检测。每组5孔，以x-±s表示（图1~2）。
2.3 RT?PCR检测Col?Ⅰ和OPN mRNA的表达
大鼠BMSCs在2组培养基培养14 d后，Col?Ⅰ和OPN mRNA均有表达（表1）。
表1 两组诱导14 d后Col?Ⅰ和OPN mRNA的Ct值（n=3）
Col?Ⅰ mRNAOPN mRNABMP2活性多肽诱导组23.80±0.23*25.54±2.72*非诱导组34.56±3.8536.03±3.54F值18.4316.57
*单因数方差分析，在α=0.05水平，F＞7.71，有显著性统计学差异。
图1诱导组与非诱导组ALP活性图2诱导组与非诱导组钙含量变化3 讨 论
BMP?2是具有特殊生物学活性的细胞因子，能诱导BMSCs向成骨方向分化。促进骨形成并表达分泌特异性成骨细胞产物，如Col?Ⅰ、OPN和OCN等。从骨组织中提取天然BMP，方法繁琐，收获量少，纯度低和重复性差〔4、5〕，难以满足研究和临床应用需要。因此，如何合理有效地合成BMP?2成了当今学者关注的热点。
目前合成的多肽种类很多，功效众说纷纭。郭晓东等〔6、7〕用合成的BMP?2活性多肽滴加于胶原海绵上，在大鼠背部一侧骶棘肌下包埋，8周取材，通过X线、组织学检查，进行比较观察异位骨形成情况。结果发现：植入区可见明显新骨形成，具有活跃的骨细胞和发育很充分的骨小梁组织。潘海涛等〔8〕用固相合成法合成K16GRGDSPC寡肽，能显著提高BMSCs基因的转染和表达。Saito等〔9~11〕根据BMP?2核苷酸序列中不同功能区合成了7条短肽，并比较其功能，发现根据BMP?2核心功能区的核苷酸序列合成的BMP?2活性多肽，能诱导鼠多潜能细胞C3H10T1／2向成骨方向分化，其碱性磷酸酶活性明显升高，与藻酸盐凝胶共价后，植入大鼠腓肠肌内，3周后植入区骨密度达250 mg／cm3，X线表现几乎与胫骨相同。Yoshihisa等〔12〕合成了一种含20个氨基酸BMP?2活性多肽，将其与藻酸盐水凝胶复合，发现和BMP?2一样具有生物学活性，能诱导异位成骨。
本实验就是BMP?2核心功能区的核苷酸序列，通过FMOC／tBu固相多肽合成法合成含24个氨基酸的寡肽——BMP?2活性多肽，BMP?2活性多肽中包含磷酸化的丝氨酸以及天冬氨酸，能够极好的模拟天然骨基质的促发及指导矿化的功能，在局部形成偏酸的环境，促进局部的钙磷沉积、成核和生物自组装矿化。同时，短链多肽活性位点能充分暴露并与细胞表面受体结合，生物活性更强，它在与胶原海绵材料复合过程中稳定性更好，复合后随着胶原海绵本体的逐渐降解而释放，持续时间更长〔13〕。并且，BMP?2活性肽生长因子作为分子诱导信号，通过特定的细胞通讯与信息传递系统对细胞的黏附和向成骨方向定向分化等生物学行为进行精确的调控，即具有了很好的骨诱导活性。其分子量小，空间结构呈螺旋状，活性位点易于暴露，功能发挥稳定。以往的相关研究也证实了该BMP?2活性多肽具有体外定向诱导大鼠BMSCs向成骨方向分化的作用〔14、15〕。
碱性磷酸酶（ALP）和钙含量是成熟的成骨细胞的标志之一，其活性的高低也可反映成骨细胞的成熟状况。Col?Ⅰ为骨组织中的成骨细胞合成的特异性胶原蛋白，Col?Ⅰ的量反映了成骨细胞的成熟状况。试验结果表明：用条件培养基培养3～4 d后，培养细胞发生明显的形态变化，由梭形转变为肥硕梭形或多角形，表现出明显的成骨分化趋势。随条件培养基中BMP?2活性多肽浓度的增加，细胞发生成骨性改变的时间有所提前。ALP活性检测：BMP?2活性多肽诱导组ALP较非诱导组明显增加，并于诱导15 d达高峰，以后进入平台期。同理，钙含量BMP?2活性多肽诱导组也较非诱导组明显增加。Ⅰ型胶原和骨桥蛋白mRNA的表达通过实时定量RT?PCR检测发现：接种14 d，Col?ⅠmRNA和OPN mRNA在成骨诱导培养基组均有表达，更进一步说明了BMP?2活性多肽在体外诱导BMSCs向成骨方向分化的作用。
【】
〔1〕 Ebara S，Nadayama K.Mechanism for the action of bone morphogenetic proteins and regulation of their activity［J］.Spine,2002，27（16 Suppl 1）：10?15.
〔2〕 郑军，齐新生.骨形态发生蛋白在骨缺损和坏死修复中的成骨机制和运用［J］.矫形外科杂志,2004，12（23、24）：1888?1890.
〔3〕 马文辉，时述山，李亚非.骨修复中骨形态发生蛋白（BMP）成骨机理的研究及其应用现状［J］.中国矫形外科杂志,2001，8（2）：167?170.
〔4〕 Wozney JM，Seeherman HJ.Protein?based tissue engineering in bone and cartilage repair［J］.Curr Opin Biotechnol,2004，15（5）：392?398.
〔5〕 Saito N，Takaoka K.New synthetic biodegradable polymers as BMP carriers for bone tissue engineering［J］.Biomaterials,2003，24（13）：2287?2293.
〔6〕 郭晓东，袁泉，郑启新，等.具有骨诱导活性的仿生骨基质材料的制备［J］.中华实验外科杂志,2006，23（8）：213?217.
〔7〕 Guo XD,Yuan Q,Zheng QX,et al.Biologically inspired self?assembling synthesis of bone?like nano?hydroxyapatite /PLGA?（PEG?ASP）n composite:a new biomimetic bone tissue engineering scaffold material［J］.J Wuhan Univer Technol Mater Sci Ed,2005,20（Suppl）:234?237.
〔8〕 潘海涛，郑启新，郭晓东，等.新型靶向性非病毒载体K16GRDSPC转染骨髓基质细胞的条件优化［J］.华中科技大学学报（医学报），2006,35（3）:369?372.
〔9〕 Saito A,Suzuki Y,Ogata S,et al.Activation of osteo?progenitor cells by a novel synthetic peptide derived from the bone morphogenetic protein?2 knuckle epitope［J］.Biochem Biophys Acta,2003,23（9）:60?67.
〔10〕 Saito A,Suzuki Y,Ogata S,et al.Prolonged ectopic calcification induced by BMP?2?derived synthetic peptide［J］.J Biomed Mater Res A,2004,70（1）:115?121.
〔11〕 Saito A,Suzuki Y,Ogata S,et al.Accelerated bone repair with the use of a synthetic BMP?2?derived peptide and bone?marrow stromal cells［J］.J Biomed Mater Res A,2005,72（1）:77?82.
〔12〕 Yoshihisa S,Masao T,Kyoko S,et al.Alginate hydrogel linked with synthetic oligopeptidederived from BMP?2 allows ectopic osteoinduction in vivo［J］.J Biomed Mater Res,2000,50：405?409.
〔13〕 Tsumaki N,Yoshikawa H.The role of bone morphogenetic proteins in endochondral bone formation［J］.Cytokine and Growth Factor Reviews,2005,16（3）:279?285.
〔14〕 段智霞，郑启新，郭晓东，等.BMP?2活性多肽/PLGA?［ASP?PEG］复合物植入异位成骨的实验研究［J］.郑州大学学报,2007,42（3）:441?444.
〔15〕 Duan ZX,Zheng QX,Guo XD,et al.Experimental research on ectopic osteogenesis of BMP?2?derived peptide P24 combined with PLGA copolymers［J］.J Wuhan Univer Techhol Mater Sci Ed,2007,27（2）:179?182.
