人工关节金属磨损颗粒体外制备分离方法的实验研究
【摘要】 设计一种体外制备、分离人工关节金属磨损颗粒的方法，并验证这种颗粒用于医学实验的可行性。［方法］用钛铝钒合金、钴铬钼合金材料分别制成球磨罐(国家发明专利，申请号：03142073. 7), 球磨罐内装有用同种材料制成的磨块; 向该球磨罐内注入模拟生物体液; 震动球磨得到颗粒混悬液。梯度离心获得金属颗粒。对颗粒进行：(1)元素成分鉴定；(2)颗粒大小鉴定和粒度分析；(3)扫描电镜对颗粒的表面形态观察；(4)将颗粒与J774A. 1巨噬细胞共同培养，观察细胞吞噬颗粒的情况。［结果］通过此方法成功产生并分离出大量直径1 μm左右的钛合金和钴铬钼合金颗粒。(1)元素分析证实整个处理过程中无杂质成分污染；(2)钛合金颗粒的平均直径Dv90∶1. 009，钴铬钼颗粒的平均直径Dv90∶1. 008，粒度分布曲线基本成正态；(3)扫描电镜图象显示颗粒大小均匀，形状多为不规则，与体内颗粒极为相似；(4)J774A. 1巨噬细胞能完整吞噬2种材料的颗粒。［结论］此方法能持续大量产生人工关节假体金属材料的磨损颗粒，产生的颗粒能在各方面很好地模拟体内磨损颗粒，为今后人工关节假体松动相关研究的体内、体外研究提供可靠的颗粒来源。
【关键词】 人工关节 生物相容性材料 磨损颗粒 体内研究 体外研究
Abstract：［Objective］To design a method of in vitro preparation and seperation for metallic wear particles around joint prosthesis and evaluate its feasibility in medical experiments. ［Method］Ti-6Al-4V and Co-Gr-Mo alloys were used to make two friction jars respectirely. National inventive patent applied number 03142073.7.Lots of quadrate blocks made of the same materials are put into the jars respectively, which were then. lubri cated by man?made body fluid and vibrated on a bottle shaker. After 21 days the fluid was harvested and centrifuged to get the produced wear particles. The collected particles were studied by using element trace analysis, laser countersizer and scanning electron microscopy. The J774.A1 macrophages cultured together with these particles for 24 hours were observed under inverted phase contrast microscopy and transmission electron microscopy.［Result］A got great amounts of metallic particles with 1μm diameter coned beproduce using this method. The aver age diameter of titanium alloys (Dv90) is 1.011 and that of Co?Gr?Mo is 1.010. Particle size distribution had good consistency in different materials. Under scanning electron microscopy ,the particles had irregular shapes just like those got from revision operations. The particles taken into the J774.A1 macrophages could be seen under inverted p hase contrast microscopy and transmission electron microscopy.［Conclusion］This method is good enough to producl lots of metallic wear particles mosth like those around total joint prosthesis and can be used in further in vivo and in vitro studies about joint prosthesis loosening.
Key words：artifitial joint; biomechanical receptive material; wear particle; in vivo; in vitro
人工关节假体晚期松动是长期困扰骨科领域的难题。长期的研究形成共识：假体材料磨损颗粒引发的由巨噬细胞介导的破骨细胞性骨吸收是假体松动的主要生物学原因［1］。随着各种新型生物金属材料的不断产生和人们对金属-金属人工关节假体的重新评价，细小金属颗粒在假体松动中的作用又成为了研究的热点［2，3］。为解决人工关节松动相关研究中颗粒来源匮乏的问题，本研究在Rogers［4］方法的基础上设计出一种体外产生生物金属材料细小磨损颗粒的方法，采用此方法成功制成了直径1 μm的钛合金和钴铬钼合金颗粒。并对颗粒的成份、大小、形态和粒度分布进行分析观察。颗粒与巨噬细胞体外培养中观察吞噬的方法初步验证颗粒用于医学实验的可行性。
1 材料与方法
1. 1 颗粒制备装置的研制
原料选用医用钛铝钒合金（上海思爱高科技开发有限公司提供）和钴铬钼合金（北京力达康科技有限公司提供）。采用非焊接技术制成3个中空的椭球形球磨罐（100 mm×70 mm×70 mm）和立方形磨块若干（5 mm×5 mm×5 mm）。顶部开口处采用螺纹旋入式顶盖，加用聚乙烯的垫圈，以提高系统的密封性能，在设计上确保聚乙烯垫圈不外露于容器的内壁，以防止混入聚乙烯磨损颗粒。底部支架使磨罐能在平面放置（图1、2）。本装置的所有组件按ASTM F86-76标准进行清洗，75%酒精浸泡，高温灭菌（121℃、15 min）后备用。
生物金属颗粒产生装置及分离保存方法已申请国家发明专利。
发明名称：一种生物金属材料超细粉末的制备方法及其制备装置。
专利申请号：03142073. 7
1. 2 磨损颗粒的制备、离心分离与保存
无菌条件下打开顶盖，将磨块放入球磨罐中，加入事先配制好模拟生物体液（PBS+2%小牛血清+5 IU/ml青霉素+5 μg/ml链霉素）75 ml作为润滑液。装置至于摇床上，摇晃72 h，弃掉润滑液，重新加入润滑液75 ml，摇晃21 d。收集润滑液与磨损颗粒的混悬液，加润滑液至80 ml待用。
将钴铬钼合金混悬液80 ml分装在8个10 ml的试管中，500 r/min离心2 min，弃沉淀物，重新加润滑液至10 ml，重复2次。1 000 r/min离心5 min，弃上清，重新加润滑液至10 ml, 重复1 000 r/min离心5 min 1次，加润滑液至4 ml, -20℃冻存备用。
将钛合金混悬液80 ml分装在8个10 ml的试管中，500 r/min离心4 min，弃沉淀物，重新加润滑液至10 ml，重复2次。1 000 r/min离心40 min，弃上清，重新加润滑液至10 ml, 重复1 000 r/min离心40 min一次，加润滑液至4 ml, -20℃冻存备用。
1. 3 磨损颗粒成分元素分析
随机抽样选取钛铝钒合金原料和磨损颗粒样品各一份进行元素分析。秤取0. 1 g原料和磨损颗粒样品，于聚四氟乙烯烧杯中，加入10 ml HF（分析纯），加热1 h，加入10 ml H2SO4(GR), 加热1 h，定容于500 ml容量瓶中。取液进入等离子体发射光谱仪（IRIS Advantage 1000 美国），仪器自动读出样品元素组成。
1. 4 磨损颗粒的粒度分析
用润滑液（PBS+2%小牛血清+5 IU/ml青霉素+5 μg/ml链霉素）进入激光粒度仪（TSL?100 上海理工大学研制）校准调零。取颗粒混悬液4 ml, 在旋涡混合器上充分混匀，进入激光粒度仪，机自动颗粒浓度、粒度数据和粒度分布曲线。
1. 5 磨损颗粒的扫描电镜观察
取颗粒混悬液50 ml，滴加到孔径为0. 22 μm的滤膜上，烘干48 h后表面真空离子喷金，扫描显微镜（QUANTA?200 荷兰）进行观察并摄取图像。
1. 6 巨噬细胞培养与吞噬实验
J774A. 1巨噬细胞株来源于BALB/c小鼠网状细胞肉瘤，由American Type Culture Collection Co. （Rockville, MD, USA）提供，培养在含10%小牛血清、100 μg /ml青霉素、100 μg /ml链霉素和2%谷氨酰胺的DMEM培养液，于37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。收集对数生长期的细胞，以2×105/ml接种于6孔板中，培养4～6 h后，加入体外制备的钴铬钼合金颗粒混悬液（107个/孔），另外于35 mm培养皿中按上述方法接种细胞，刺激24 h后用2. 5%戊二醛溶液固定，进行倒置相差显微镜观察。同时设置不加任何刺激物的对照孔。
1. 7 巨噬细胞透射电镜观察
J774A. 1巨噬细胞分别加入钴铬钼合金颗粒混悬液和钛铝钒合金颗粒混悬液（107个/孔），作用24 h后用2. 5%戊二醛溶液固定。用橡皮刮子将全部细胞从皿底轻轻刮下，收集在离心管中离心2 000 r/min 20 min，弃上清，将沉淀的细胞团块取出，用棉花纸包裹起来，然后进行漂洗、1%锇酸后固定15 min、漂洗、脱水、浸透，将样品从棉花纸内取出进行包埋，60℃烘箱内48 h，超薄切片，透射电镜（HITACHI H-500 日本）观察并摄像。
2 结 果
2. 1 磨损颗粒成分元素分析
分析结果显示：实验中获得的钛铝钒合金颗粒的元素构成与其原料基本相同（表1），证实磨损颗粒的产生过程中无杂质元素污染。 表1 钛铝钒合金磨损颗粒的元素分析结果
2. 2 磨损颗粒的粒度分析
钛铝钒颗粒的平均直径Dv90∶1. 009，99. 93%的颗粒直径在0. 3～1. 2 μm之间；钴铬钼颗粒的平均直径Dv90∶1. 008，99. 93%的颗粒直径在0. 3～1. 2 μm之间；2种颗粒粒度分布曲线形态非常相似（图3、4）。
2. 3 磨损颗粒的扫描电镜观察
镜下可见体外制备的钛铝钒合金颗粒呈片状、盘状、柱状、针状等各种不规则形状，表面有低密度的血清蛋白沉积（图5）。未见明显的颗粒叠加和成团聚集的情况。大小颗粒在滤膜上分布不均匀，大颗粒集中在边缘上，小颗粒集中在中心部位。
体外制造的钴铬钼合金颗粒也有片状、盘状、柱状、针状等各种不规则形状，钴铬钼合金颗粒更多为块状颗粒，是由于颗粒轻度聚集，显得体积更大（图6）。
与体内分离颗粒对照发现，颗粒的形态均非常近似，表面都有蛋白沉积。体内分离颗粒大小分布更加不均匀（图 7）。
2. 4 巨噬细胞培养与吞噬实验
J774A. 1巨噬细胞经合适的条件培养24 h后细胞生长旺盛，吞噬活性较强。倒置相差显微镜下细胞成圆形或椭圆形，细胞轮廓清晰，胞浆内无明显吞噬小体（图8）。与体外制备的钴铬钼颗粒共同培养24 h后，镜下细胞形态发生变化。细胞密度减小，细胞肿胀成圆形，胞核变大，甚至见到细胞大片坏死，核溶解，细胞碎裂，胞浆内有被吞噬的钴铬钼颗粒影像（图9）。
2. 5 培养的巨噬细胞透射电镜观察
当金属颗粒接近J774A. 1巨噬细胞时，细胞伸出伪足逐渐将较小的颗粒吞噬入细胞内。此时细胞开始张大，胞浆内线粒体和粗面内质网增生，表示分泌活动活跃，颗粒进入细胞成为吞噬体。胞浆密度变得不均匀，有空泡样变（图10）。
3 讨 论
为阐明假体松动的机理和对新型假体材料的生物相容性进行评价，众多学者采用体外细胞培养、组织培养、体内植入等方法对颗粒引发的生物学反应进行研究［5～7］。由于体内颗粒来源有限，国内学者常采用简单的材料对磨、过筛或接受国外赠送的方法体外获得颗粒，而国外学者采用的方法有对磨（milling）、金属熔体雾化（aerosolization）、气化（gas atomization）、激光制粉法等［4］。由于来源杂乱，颗粒的各项特性变异较大，使大量的实验数据因无法重复和比较而失去实际意义。如何体外产生生物金属的颗粒并使之能很好地模拟体内颗粒是一个普遍地急需解决的问题。
大量的研究已经显示：磨损颗粒的物理、化学性质是影响机体反应程度和假体松动的关键因素。这些性质包括：颗粒数量、大小、粒度分布、表面积、化学元素构成、表面形态、可溶性金属离子释放、表面电荷等［5］。使体外生成的颗粒最大限度地模拟体内磨损颗粒是作者设计这个方法时始终坚持的原则。
3. 1 颗粒的产生方法
人工关节周围的金属磨损颗粒可以来源于关节面、柄-骨界面、假体-骨水泥界面、臼杯-骨界面、组合式假体的柄-头结合处。从磨损机理上讲属于表面摩擦磨损，因此借鉴球磨的方法产生颗粒是合理的。作者自行设计的球磨罐具有以下特点：(1)采用相同的材料加工球磨罐和磨块，无焊接工艺和罐口的密封装置避免了任何其它材料参与摩擦，保证了颗粒的纯净；(2)润滑液采用PBS+2%小牛血清+5 IU/ml青霉素+5 μg/ml链霉素，动物血清对颗粒进行预孵化(preincubation)，经蛋白孵化的颗粒的生物学行为更接近体内颗粒。在实践中作者发现，预孵化过程能在颗粒表面形成蛋白保护膜，明显减少颗粒的聚集成团现象，有利于颗粒的离心分离和电镜观察；(3)本装置的所有组件按ASTM F86-76标准进行清洗，75%酒精浸泡，高温灭菌，无菌操作过程和含抗生素的润滑液都保证了颗粒无微生物和内毒素污染，这对于体内和体外医学实验是非常重要的；(4)低能量缓慢摇晃和润滑液的加入，使磨块与罐壁、磨块与磨块之间进行缓慢的摩擦，产生细小的颗粒，筛选效率提高。
3. 2 颗粒的分离方法
本实验采用“梯度离心”的方法对颗粒进行筛选。其原理来自于Stokes' 法则：
R2=9ηh/(2t［ρ-ρ0］ω2n)
R：颗粒半径 η：润滑液黏滞度 h：样品高度 t：离心时间ρ：金属密度 ρ0：润滑液密度 ω：离心角速度 n：样品与旋转轴距离
本实验中的常规变量只有ω和t，因此公式简化为：
RCo2=4. 5×106/t(min)×ω2( r/min)
RTi2=9. 0×106/t(min)×ω2( r/min)
RCo：钴铬钼合金颗粒半径 RTi：钛合金颗粒半径 t：离心时间 ω：离心角速度
总之，本实验方法简单，设备要求不高，利于应用和推广。
3. 3 颗粒的粒度测定方法
传统的颗粒测定方法是在光镜或电镜下对颗粒进行直接计数，工作量大、精确度差。激光粒度仪利用测定激光束穿透颗粒混悬液的散射估计出颗粒的平均体积，如假设颗粒为标准球体，则可出颗粒直径。在应用中作者认为粒度仪用于人工关节颗粒分析的优势在于：测量速度快、误差小、可定量分析、操作简单，非常适合大量样本的检测与对比研究。激光粒度仪是确定颗粒大小的有效方法，但在应用中仍需注意：(1)激光粒度仪是在忽略颗粒形状差异的基础上对颗粒大小的计算和估计，所以颗粒形状对于结果有影响。光镜或电镜下对颗粒进行直接计数的方法可以弥补上述不足，并可以获得颗粒形态的直观资料，两者可以取长补短；(2)由于金属颗粒的密度大，在液体中沉降迅速，也给结果带来偏差。所以注意分离好的颗粒混悬液要尽快进行测定，测定前再次震荡混匀，有条件时可以选取甘油等高黏度悬浮液。
3. 4 方向展望
随着各种新型生物金属材料的不断产生和人们对金属-金属和陶瓷-陶瓷人工关节假体的重新评价，细小金属和陶瓷颗粒在假体松动中的作用又成为了研究的热点［2，3］。为适应这一研究发展的需要，作者正在研究能产生更加细小金属和陶瓷颗粒（直径25 nm左右）的方法。
图1 钛铝钒合金球磨罐和磨块 图2 钴铬钼合金球磨罐和磨块 图3 钛铝钒颗粒平均直径Dv90∶1. 009，99. 93%的颗粒直径在0. 3～1. 2 μm之间 图4 钴铬钼颗粒平均直径Dv90∶1. 008，99. 93%的颗粒直径在0. 3～1. 2 μm之间 图5 体外人工制造的钛铝钒合金颗粒扫描电镜显示：颗粒呈片状、盘状、柱状、针状等各种不规则形状，表面有低密度的血清蛋白沉积（2 000×） 图6 体外制备钴铬钼合金颗粒扫描电镜，铬钼合金颗粒更多为块状颗粒，是由于颗粒轻度聚集，显得体积更大（2 000×） 图7 体内分离与体外制备的钛铝钒颗粒扫描电镜比较 图7a R为体内分离颗粒 图7b 为体外制备颗粒。颗粒的形态均非常近似，表面都有血清蛋白的沉积膜，体内分离颗粒大小分布更加不均匀（R 1 000×，L 2 000×） 图8 作为空白对照组的J774A. 1巨噬细胞培养24 h后的形态，细胞成圆形或椭圆形，细胞轮廓清晰，胞浆内无明显吞噬小体（200×） 图9 J774A. 1巨噬细胞与钴铬钼颗粒共同培养24 h后的形态改变，细胞密度减小，细胞肿胀成圆形，胞核变大，甚至见到细胞大片坏死，核溶解，细胞碎裂，胞浆内有被吞噬的颗粒影像↑（200×） 图10 J774A. 1巨噬细胞内的金属颗粒，胞浆内线粒体和粗面内质网增生，颗粒进入细胞成为吞噬体，↑为金属颗粒。胞浆密度变得不均匀（3 500×）
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