组织工程前交叉韧带的研究进展
1 组织工程ACL种子细胞的选择
组织工程ACL的关键要素之一就是要选择合适的种子细胞。ACL细胞作为韧带结构和功能的基本单位，在体外培养时可以较好地保持韧带细胞表型，分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原的能力强，有利于韧带组织重建。Cooper JA等［1］将分离培养的兔ACL、内侧副韧带(MCL)、髌韧带、跟腱4种成纤维细胞分别种植于三维编织的聚乳酸(PLLA)ACL支架材料上，结果发现ACL细胞分泌I、Ⅲ型胶原和纤连蛋白(fibronectin，FN)的基因表达水平高于其它3种成纤维细胞，认为作为组织工程ACL的种子细胞，ACL细胞可能优于其它3种成纤维细胞。但ACL细胞同样存在来源限制的问题，体外培养时细胞增殖较缓慢，如能解决其快速增殖的问题，不失为理想的种子细胞。
骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSc)具有向多种组织细胞分化的潜能，可以促进韧带组织修复。Ge Z［2］、Van Eijk F［3］等对分离培养的ACL、MCL、皮肤成纤维细胞和BMSc进行比较研究，发现BMSc分泌细胞外基质(ECM)能力强、细胞增殖快，认为就细胞增殖而言，作为组织工程ACL的种子细胞，BMSc优于其它3种细胞。但韧带细胞表面没有特殊标记物［4］，BMSc如何向韧带细胞诱导分化尚无统一认识。有研究表明，在体外特定条件下，应用机械应力［5］、选择利用生长因子［6］和骨形态发生蛋白?12(BMP?12)可诱导BMSc向韧带样细胞分化［7］。但目前在体外培养的条件下，BMSc向韧带细胞诱导分化的方法和技术还不成熟。而且BMSc能否在关节内环境下继续增殖并促进韧带修复尚不清楚。BMSc要作为组织工程ACL的种子细胞尚需进行进一步研究。
2 生长因子在组织工程ACL中的作用
大量研究表明，一定量的生长因子可以促进韧带细胞增殖，有助于损伤韧带修复并能促进新生韧带血管化和增强其力学性质［8］。沈雁等［9］将成纤维细胞生长因子(aFGF、bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)加入体外分离培养的兔ACL细胞中，结果发现单独应用aFGF、bFGF或联用EGF都可以促进ACL细胞增殖；Steinert SA等［10］使用转化生长因子?β(TGF?β)老鼠MCL，发现其力学性质明显增强，认为TGF?β是促进韧带修复的重要生长因子。Hankemeier S等［11］的研究发现使用低剂量FGF?2(3 ng／ml)可以促进BMSC增殖并可提高ECM和细胞骨架成分蛋白mRNA转录水平，有助于韧带组织工程构建。但生长因子参与韧带形成的调节信号还知之甚少，有待于进一步研究［12］。目前，有关生长因子的研究主要集中在促进细胞有丝分裂方面。有关各种生长因子的作用机理、生长因子有效生理浓度的选择、利用转基因技术将目的基因导入种子细胞使生长因子可持续表达、结合可生物降解聚合物的缓释系统可使生长因子缓慢释放并持续作用等方面还需进一步探讨，可能成为今后研究生长因子的重点之一。
3 组织工程ACL支架材料的研究进展
组织工程ACL的另一个重要方向是研制和选择合适的支架材料。理想的ACL支架材料应具有以下特点：符合生物安全性要求；生物相容性良好；可生物降解性，既不会降解过快而重建失败，又不会延迟降解产生应力遮挡而影响新生组织长入；力学性能良好，重建后膝关节功能可恢复到损伤前水平并能进行早期功能锻炼，而且随着支架材料降解，在新生韧带形成前，其力学性能可保持；利于宿主组织长入，支架材料能与体内局部环境进行机械信号或生化信号联系；有一定的孔径、孔隙率和较高的比表面积；固定方法简单可靠，尽可能减少并发症等。
目前用于组织工程ACL的支架材料主要有：合成高分子材料、天然高分子材料及其复合材料。
3.1 合成高分子材料
组织工程中研究和应用最多的合成高分子材料是聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)及其共聚物(PLGA)，这类高分子材料已获FDA通过，可以用于组织工程。大量实验证明，这类材料具有良好的生物相容性、可生物降解性、力学性质可调、材料可塑性好。缺点是这类材料疏水性强、细胞黏附能力差、材料柔韧性差，经过必要的修饰后可增加细胞黏附能力。而作为组织工程ACL，其柔韧性不足的问题尚需进一步解决。
Sharon L.Bourke等［13］分三阶段使用聚碳酸酯纤维(poly?DTE carbonate)在体外构建组织工程ACL，结果发现该材料可诱导新生组织长入，人和兔的成纤维细胞可以在材料上黏附和增殖，体外降解后该材料可以很好地保持其力学性质，其抗张强度也达到人ACL要求，经过进一步研制有望成为组织工程ACL支架材料，但其生物降解性能否满足理想支架材料的要求尚需进行研究。潘政军等［14］使用聚乙烯醇-胶原(PVA／COL)复合材料在体外初步构建组织工程ACL，结果发现该复合材料具有较好的生物相容性，并能制成具有一定孔径和孔隙率的支架材料，有较好的柔韧性和一定的抗张强度，如果能通过编织或改进制备技术有望成为理想的组织工程ACL支架材料。
近年来，有学者使用三维编织技术构建组织工程ACL，编织后的材料可形成具有一定孔径和孔隙率的三维支架，其力学性能也增加，可以达到人ACL的力学要求，拓展了材料的使用范围。Helen U．Lu［15］等使用三维编织技术对PLA、PGA、PLGA纤维分别进行三维编织来构建兔ACL。实验证明，经过编织的支架材料具有较高的孔隙率和合适的孔径结构，其力学性质，如最大拉应力、抗张强度与兔ACL力学性质相似。材料经过FN修饰后可促进兔ACL细胞黏附、增殖和分泌ECM。利用PLLA纤维编织构建的人ACL支架材料，其最大拉应力可以满足人正常生理活动的需要［16］。使用编织材料是构建组织工程ACL的发展趋势。编织后的支架材料可以较好地模拟ACL纤维走向，支架材料的骨隧道和关节内部分的纤维可以形成不同的孔径结构，有利于新生组织长入，为韧带血管化和再生创造了条件［17，18］。
3.2 天然高分子材料
用于组织工程支架材料研究最多的天然高分子材料是胶原纤维。大量研究表明，胶原纤维具有良好的生物相容性、可生物降解性、对组织修复具有促进作用、经过处理基本可消除抗原性、无异物及毒性反应。而且胶原作为韧带基质的主要成分，其独特的序列结构为韧带细胞长入提供特殊的微环境并对维持韧带力学特性起着重要作用［19］。研究表明，使用未交联的胶原纤维制作的韧带支架材料其弹性模量和抗张强度均不能满足组织工程ACL的力学要求［20］。因此常需与其它弹性模量大或抗张强度高的高分子材料聚合构建组织工程韧带支架材料［21］。交联后胶原纤维的弹性模量和抗张强度大大提高［22］。但因使用了戊二醛、碳化二亚胺(EDC)等交联剂，可能会对种子细胞黏附和增殖产生不利影响。如何提高胶原纤维的力学性能仍是今后研究的重点。
异种组织材料也是组织工程ACL研究的热点。王昆等［23］使用猪肌腱通过消毒、去杂质、环氧化物交联、多方位去抗原处理等技术已初步研制成生物型人工韧带，其力学强度达到了人ACL正常生理活动的要求。体外实验证明该支架材料有较好的生物相容性，通过进一步研制有望成为组织工程ACL支架材料。异种小肠黏膜下层(small intestinal submucosa，SIS)也可作为组织工程ACL支架材料［24］。该材料具有完整的力学性能和多孔结构，允许细胞长入、生长因子渗透和血管再生，因有助于促进组织修复和重建而得到广泛关注。
Tokifumi Majima等［25］使用天然高分子材料海藻酸盐和壳聚糖通过聚合研制成复合纤维支架材料。实验证明，兔肌腱成纤维细胞可以在该支架材料上黏附、增殖并能分泌I型胶原，其抗张强度达200 MPa以上，有望作为韧带重建的理想支架材料。但其降解性能能否满足ACL的要求仍有待于进一步研究。
Gregory H．Altman等［26］使用蚕丝纤维构建组织工程ACL获得了初步成功。实验证明，蚕丝纤维具有良好的生物相容性、优良的力学性能和弹性、可以在体内通过水解而缓慢降解，是构建组织工程ACL的理想材料。特别是材料编织后，其力学性质，如极限拉伸强度(ultimate tensile strength，UTS)、线性刚度(linearstiffness)、屈服点拉应力、拉伸率等与人ACL的各项生物力学指标非常相似，而且有较强的耐疲劳性能。体外实验发现，BMSC可以在支架材料上黏附、增殖并能分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原和黏蛋白?C(tenascin?C)等ECM，是目前组织工程ACL较为理想的支架材料。以蚕丝纤维编织构建组织工程ACL的研究仍在进行中。
4 展望
目前，组织工程ACL在某些方面取得了一定的进展，但与临床要求尚有一段距离，在很多方面仍需进一步研究和探索，如促进ACL细胞快速大量增殖的技术、生长因子的持续表达、理想的组织工程ACL支架材料的研制、组织工程ACL的固定、支架材料与界骨面之间的愈合、如何促进支架材料的血管化和韧带化等。
【】
［1］ Cooper JA, Bailey LO, Carter JN, et al. Evaluation of the anterior cruciate ligament,medial collateral ligament,achilles tendon and patellar tendon as cell sources for tissue?engineered ligament［J］. Biomaterial， 2006,27(13):2747-2754.
［2］ Ge Z, Goh JC, Lee EH. Selection of cell source for ligament tissue engineering［J］.Cell Transplant， 2005,14(8):573-583.
［３］ Van Eijk F, Saris DB, Riesle J, et al. Tissue engineering of ligaments: a comparison of bone marrow stromal cells, anterior cruciate ligament, and skin fibroblasts as cellsource［J］. Tissue Eng，2004,10(5-6):893-903.
［４］ Vunjak?Novakovic G， Gregory A, Rebecca H, et al. Tissue engineering of ligaments［J］. Annu Rev Biomed Eng， 2004，6:131-156.
［５］ Altman GH, Horan R, Martin I, et al. Cell differentiation by mechanical stress［J］.FASEB J， 2001,16:270-272.
［6］ Jodie E, Moreau, Jingsong C , et al. Growth factor induced fibroblast differentiation from human bone marrow stromal cells in vitro［J］. Joumal of Orthopaedic Research 2005,(23):164-174.
［７］ 曲彦隆，孟祥文，周晓光，等.BMP-12诱导下对骨髓基质干细胞分化潜能及生物学行为影响的实验研究［J］.伤残医学杂志，2005，13(4)：1-3.
［8］ John AK, Clemente I, Scott AR. Tissue?engineered ligament: cells,matrix, and growth factors［J］. Tissue Engingering in Orthopedic Surgery, 2000, 31(3):437-452.
［9］ 沈雁，陈鸿辉，李贤让，等.成纤维细胞生长因子和表皮生长因子及复合因子对兔ACL、MCL体外增殖作用［J］. 修复重建外科杂志，2005，19(3)：229-233.
［10］Steinert SA, Palmer GD,Evans CH. Gene therapy in the musculosketal system［J］.Current Opinion in Orthopaedics， 2004，15:318-324.
［11］Hankemeier S, Keus M, Zeichen J,et al. Modulation of proliferation and differentiation of human bone marrow stromal cells by fibroblast growth factor 2:potential implications for tissue engineering of tendons and ligaments［J］. Tissue Eng，2005,11(1-2):41-49.
［12］James CG, Hong?wei OY, Swee?hin TEOH, et al. Tissue?engineering approach to the repair and regeneration of tendon and ligaments［J］.Tissue Enigneering，2003, (9):31-43.
［13］Sharon L， Bourke, Joachim K.Dunn. Preliminary development of anovel resorbable synthetic polymer fiber for anterior cruciate ligament reconstruction［J］.Tissue Engineering， 2004,10(1/2):43-52.
［14］潘政军，陈鸿辉，叶春婷，等.聚乙烯醇/胶原共聚物在组织工程前交叉韧带支架材料中的实验研究［J］.中国矫形外科杂志，2004，12(5)：368-370.
［15］Helen HL, James AC, Sharron M, et al. Anterior cruciate ligament regeneration using braided biodegradable scaffolds: in vitro optimization studies［J］.Biomaterials, 2005,26,4805-4816.
［16］James AC, Helen HL, Frank KK, et al. Fiber?based tissue?engineered scaffold for ligament replacement: design considerations and in vitro evaluation［J］.Biomaterials, 2005,26,1523-1532.
［17］Cato TL,Joseph WF. Ligament tissue engineering: An evolutionary materials science approach［J］. Biomaterials， 2005,26,7530-7536.
［18］Z. GE,JCH GOH, L WANG, et al. Characterization of knitted polymeric scaffolds for potential use in ligament tissue engineering［J］. J Biomater Sci Polymer Edn， 2005,16(9):1179-1192.
［19］Paolo P， Provenzano, Ray V Jr. Collagen fibril morphology and organization:implications for force transmission in ligament and tendon［J］. Matrix Biology， 2006,25:71-84.
［20］Noth U, Schupp K, Heyer A, et al. Anterior cruciate ligament constructs fabricated from human mesenchymal stem cells in a collagen type I hydrogel［J］.Cytotherapy, 2005,7(5):447-455.
［21］Guoping C, Takashi S, Masataka S,et al. Application of PLGA?collagen hybrid mesh for three?dimensional culture of canine anterior cruciate ligament cells［J］. Materials Science and Engineering C， 2004,24:861-866.
［22］Eileen G, Andrea NL, Darryl AD,et al. Mechanical characterization of collagen fibers and scaffolds for tissue engineering［J］.Biomaterials, 2003,24:3805-3813.
［23］王昆，蔡道章.生物型人工韧带的制备及体外形态学、细胞相容性和力学特性的观察［R］.2005，广东省人体生物组织工程学会第三次学术会议文稿.
［24］Volker M,Steven DA, Thomas WG, et al. The use of porcine small intestinal submucosa to enhance the healing of the medial collateral ligament:a functional tissue engineering study in rabbits［J］. Journal of Orthopaedic Research,2004,22:214-220.
［25］Tokifumi M,Tadanao F,Norimasa I,et al. Alginate and chitosan polyion complex hybrid fibers for scaffolds in ligament and tendon tissue engineering［J］. J Orthop Sci,2005,10:302-307.
［26］Gregory H, Altman, Rebecca L,et al. Silk matrix for tissue engineered anterior cruciate ligaments［J］. Biomaterials,2002,23:4131-4141.
