不同浓度丝裂霉素C预防椎板切除术后硬膜外黏连的实验研究

【摘要】  ［目的］比较局部应用不同浓度丝裂霉素C（MMC）预防椎板切除术后硬膜外黏连的效果。［方法］40只SD大鼠随机分为4组，分别切除L1椎板。术中各组分别以棉片浸透生理盐水（C组）、0.01 mg／ml（L组）、0.05 mg／ml（M组）、0.1 mg／ml（H组）MMC，置于裸露的硬脊膜后5 min。术后第4周处死动物取材，分别作肉眼观察、羟脯氨酸（HOP）含量测定、胶原组织面积测定及成纤维细胞记数。［结果］C组标本硬膜外瘢痕组织致密，与硬脊膜形成紧密黏连。H组无明显硬膜外黏连，HOP含量、胶原组织面积及成纤维细胞记数显著减少。M、L组HOP含量、胶原组织面积及成纤维细胞记数不同程度的减少，但不能避免硬膜外黏连的形成。［结论］局部应用浓度为0.1 mg／ml的MMC能够有效减少硬膜外瘢痕组织增生，避免椎板切除术后硬膜外瘢痕黏连。

【关键词】  椎板切除术； 硬膜； 黏连； 丝裂霉素C； 浓度

　　椎板切除术后硬膜外瘢痕形成是引起腰椎手术失败综合征的重要原因之一。丝裂霉素C（mitomycin C，MMC）作为一种具有抑制成纤维细胞细胞增殖作用的抗代谢药物，其抑制瘢痕形成的作用已经在临床实践中得到成熟运用。本研究采用定性和定量的方法探讨局部应用不同浓度的MMC预防椎板切除术后硬膜外瘢痕的形成的效果。
   
　　1  材料与方法
   
　　1.1  动物分组
  
　　健康成年雄性SD大鼠40只，体重200～220 g。随机分为4组，每组10只。各组动物椎板切除术后硬膜外局部应用的MMC分别为：高浓度（H）组：MMC 0.1 mg／ml；中浓度（M）组：MMC 0.05 mg／ml；低浓度（L）组：MMC 0.01 mg／ml；对照（C）组：生理盐水。
   
　　1.2  制作动物模型
   
　　大鼠以氯胺酮（100 mg／kg）腹腔注射麻醉后，俯卧位固定，取脊柱正中切口，显露L1和L2椎板，切除L1椎板，暴露硬脊膜，压迫止血。C组以浸透生理盐水棉片，H组、M组、L组以浸透不同浓度的MMC棉片置于裸露的硬脊膜后方5 min后取出，每只动物都以生理盐水冲洗3次共20 ml，逐层缝合手术切口。
   
　　1.3  观察指标及方法
   
　　术后观察实验动物手术切口愈合情况及肢体运动情况，于手术4周后随机处死每组各4只动物，肉眼观察硬膜外黏连情况，切取手术段脊柱硬脊膜后部大小约为0.2 cm×0.1 cm×0.5cm组织，漂洗、称重、匀浆，离心取上清，消化，加入HOP显色剂，测定吸光度，推算出每毫克湿组织HOP的含量（μg）。其余动物分别以氯胺酮（100 mg／kg）腹腔注射麻醉后，以PBS和4%多聚甲醛依次作动脉灌注后切取手术段脊柱包括其后侧瘢痕组织及骶棘肌。经6%硝酸脱钙，常规脱水，石蜡包埋，切片，分别作HE染色和Masson染色。在光镜下主观评估各组标本硬膜外瘢痕黏连的程度，并观察脊髓、神经根、骶棘肌的组织结构变化。
   
　　Masson染色组织切片取同一放大率的组织图像（×50倍），输入机，经处理，选取1 000 μm×2 000 μm范围作为测量区域，避开背部筋膜组织，测出不规则形态的瘢痕横切面面积。
   
　　HE染色组织切片取同一放大率的组织图像（×400倍），输入计算机，选取100 μm×100 μm作为计数范围，作成纤维细胞计数。每标本计数3个不同区域，取其平均值。
   
　　1.4  统计学方法
   
　　分析数据资料以均数±标准差（x-±s）表示，各组定量测定结果采用单因素方差分析和组间两两比较，检验的显著性水平为P＜0.05。应用SPSS 10.0统计软件完成统计运算。
   
　　2  结果
   
　　2.1  大体观察及硬膜外瘢痕组织中HOP含量测定
   
　　所有动物切口愈合良好，活动敏捷，无步态异常。肉眼观察H组硬膜与瘢痕组织分离后仍保持完整。C组硬膜与瘢痕无法钝性分离。M组、L组硬膜与瘢痕部分紧密黏连无法完整钝性分离。
   
　　和C组比较，H组HOP含量明显降低，具有显著性差异（P＜0.05）；M组、L组HOP含量也显示了降低趋势，但三者差异无统计学意义（表1）。

　　表1  硬膜外瘢痕组织中HOP的含量（略）

　　*与对照组比较有显著性差异P＜0.05

　　2.2  光镜观察及计算机图像分析
   
　　C组硬膜外胶原组织大量增生，形成致密瘢痕，与背部筋膜、肌间隔连成一体。硬膜外大量致密的胶原纤维与硬膜平行排列，成纤维细胞与纤维细胞混杂，数量较多，瘢痕组织与硬膜黏连紧密，难以区分（图1）。H组硬膜外胶原组织增生明显减少，瘢痕组织结构疏松。硬膜外胶原纤维亦与硬膜平行排列，成纤维细胞数量少，瘢痕组织与硬膜之间可见明显间隙或形成纤维素样黏连。部分组织切片中可见硬膜与瘢痕组织完全脱离（图2）。M、L组硬膜外胶原组织增生较多，胶原纤维排列紧密。瘢痕组织与硬膜形成不连续的黏连，部分区域黏连紧密，部分区域黏连疏松（图3、4）。各组脊髓、神经根、肌肉的组织学结构未发现明显异常。

   
　　机图像分析显示，H组横切面胶原组织明显低于C组，两者差异具有显著性（P＜0.05）；M组、L组胶原组织面积低于C组，但三者差异无统计学意义。各组成纤维细胞记数随MMC浓度增加呈递减趋势。H、M组明显低于C组，差异具有显著性（P＜0.05），L组虽低于C组，但二者差异无统计学意义（表2）。

　　表2  横切面胶原组织面积测定、成纤维细胞计数（略）

　　*与对照组比较有显著性差异P＜0.05

　　3  讨论
   
　　硬膜外瘢痕黏连的实质是纤维结缔组织增生来修复椎板切除造成的局部缺损。目前较为常用的预防措施是以各种半流体物质或者膜性材料作为硬膜与瘢痕之间的物理屏障〔1、2〕。但效果并不令人满意，而且，作为异物植入的一些副作用以及操作过程的繁琐使之不能作为理想的方法。抑制作为修复细胞主要成分的成纤维细胞增殖，调节胶原代谢成为当前生物学防治病理性瘢痕的热点。Ribeiro等〔3〕通过局部应用MMC有效地抑制了大鼠背部伤口愈合过程中瘢痕组织的形成。体外细胞培养中发现MMC是成纤维细胞增殖的有效抑制剂，MMC抑制成纤维细胞的增殖并未依赖其细胞毒作用，而是抑制了成纤维细胞向增殖表型的转化，使局部的成纤维细胞数目，特别是具有增殖活力的成纤维细胞的数目相对减少〔4〕。青光眼滤过手术中应用一定浓度的MMC能有效抑制成纤维细胞的增殖，减少胶原的沉积。MMC在低氧环境下活性增加，所以在伤口血管形成之前用，即术中能有效阻止纤维化。这些资料还表明MMC在组织内浓度很低但其抑制作用能长期保持〔5、6〕。由于硬脊膜与角膜都起源于中外胚层，在组织学上具有同源性。本实验采用与青光眼滤过手术相似的方法在椎板切除术中应用不同浓度的MMC溶液作用于硬膜后和神经根周围，观察其抑制成纤维细胞增殖，减少瘢痕组织形成的效果。
   
　　大体和组织形态学观察显示术中经过0.1 mg／ml MMC处理，大鼠术后硬膜外瘢痕组织形成减少，结构疏松，硬脊膜与瘢痕组织不形成紧密黏连，能完整分离。说明MMC预防硬膜外瘢痕黏连具有可行性。
   
　　胶原蛋白是构成瘢痕组织中胶原纤维的主要成分，HOP为其主要成分之一。胶原以外的蛋白质，除弹性蛋白含少量HOP外，均不含HOP，因此瘢痕组织中的HOP含量可作为胶原组织含量的重要指标。本实验结果显示H组大鼠硬膜外瘢痕组织中胶原组织的形成受到了MMC的有效抑制。
 
　　图1C组硬膜外胶原组织大量增生，硬膜（D）与瘢痕组织黏连紧密。成纤维细胞数量较多（Masson染色  ×400）（略） 

　　图2H组硬膜外胶原组织少，瘢痕组织结构疏松，成纤维细胞数量较少，瘢痕组织与硬膜之间可见明显间隙（Masson染色  ×400）（略） 
　　图3M组硬膜外瘢痕组织结构较C组疏松，硬脊膜与瘢痕组织之间形成不完全黏连（Masson染色  ×400） （略）

　　图4L组硬膜外瘢痕组织结构较为致密，硬脊膜与瘢痕组织之间黏连较为紧密（Masson染色  ×400）（略）
   
　　应用图像分析系统事先设定瘢痕组织的面积的测定和成纤维细胞记数的部位和范围，减少了主观因素对实验结果的影响。结果表明MMC与其抑制成纤维细胞增殖、硬膜外瘢痕组织形成的作用具有浓度-效应关系。0.1 mg／ml的MMC能够有效预防椎板切除术后硬膜外瘢痕黏连。
   
　　MMC作为一种抗肿瘤药物，他的副作用是药物在其作用部位发挥药理作用的结果。由于对细胞增殖的非特异性抑制作用，MMC必然影响与之接触的其他代谢旺盛组织，其影响程度与药物剂量密切相关〔6〕，因此药物的浓度和维持时间是影响并发症的重要因素，采用较低的有效浓度和较短的作用时间并将二者有机的统一可有效地减少并发症。
   
　　由于手术中仅有切口深部的部分创面以及裸露的硬脊膜接触过MMC，实验中发现实验组动物的运动功能和切口愈合未受影响。经MMC处理的大鼠硬膜、神经根、肌肉组织，由于其接触的药物浓度低、接触时间短，实验中观察其组织学结构未发现异常。Ilbay以0.5 mg／ml MMC作用于大鼠坐骨神经5 min并未对神经组织造成严重损伤〔7〕。本方法的安全性值得信赖。
   

【】
  　　〔1〕 张兴林.异体硬脊膜与透明质酸钠联合应用预防椎板切除术后硬脊膜黏连［J］.矫形外科杂志，2000，7（11）：1101.

　　〔2〕 闻久全，蒋阅，陈江华，等.应用人工硬脊膜预防瘢痕黏连早期临床观察［J］.中国矫形外科杂志,2003，11（12）：821?822.

　　〔3〕 Ribeiro FDQ，Guaraldo L，Borges JD，et al.Clinical and histological healing of surgical wounds treated with mitomycin C［J］.Laryngoscope,2004，114（1）：148?152.

　　〔4〕 胡丹，惠延年，Philip P,et al.丝裂霉素C抑制人结膜囊成纤维细胞生长及增殖［J］.第四军医大学学报，2001，22（13）：1230?1232.

　　〔5〕 Cincik H，Gungor A，Cekin E，et al.Effects of topical application of mitomycin C and 5?fluorouracil on myringotomy in rats［J］.Otology & Neurotology,2005,26（3）：351?354.

　　〔6〕 赵鸣，俞晓艺，蒋凌.5?氟尿嘧啶及丝裂霉素C在翼状胬肉术中的应用［J］.眼外伤职业眼病杂志，2002，24（2）：230.

　　〔7〕 Ilbay K,Etus V,Yildiz K,et al.Topical application of mitomycin C prevents epineural scar formation in rats［J］.Neurosurg Rev，2005，28（2）：148?153.

学康，曹晓建，张宁，王贯中，贾惠英