HPV18E2蛋白CTL表位多肽的构建与表达

【摘要】  目的 分析HPV18E2蛋白的CTL表位，合成并纯化这些表位多肽，构建表达HPV18E2蛋白的靶细胞，检验特异性CTL对靶细胞的杀伤效果，为进一步研制人乳头瘤病毒18型(HPV18)基因工程疫苗打下基础。方法 以重组质粒(pBR322?HPV18)为模板，利用PCR方法扩增HPV18E2 DNA片段，将HPV18E2 DNA与加强绿色荧光质粒(pIRES2?EGFP)重组构建重组质粒(pIRES2?HPV18E2?EGFP)。用酶切电泳及测序检查质粒重组后序列正确性。重组质粒转染Hela细胞。51Cr释放实验评估CTL杀伤能力。结果 克隆重组质粒pIRES2?HPV18E2?EGFP酶切后显示的酶切图谱与预期相同，而且测序验证插入片段全序列无改变。转染并用G418筛选后，在荧光显微镜下可见绿色荧光细胞的表达。三条候选多肽特异性杀伤能力分别为60.00%、71.29%和80.00%。结论 三条备选肽段都具有明显的杀伤效应，均为HPV18E2蛋白的有效CTL表位。

【关键词】  人乳头瘤病毒18型；E2基因；多肽

　　Construction and expression of recombinant plasmid pIRES2?HPV18?EGFP

    Abstract: Objective   To analyse the function of epitope?specifical HPV18E2 CTL. Methods  The E2 gene of HPV18 was amplified by PCR from pBR322?HPV18 and cloned into pIRES2?EGFP. The sequence of cloned HPV18E2 was confirmed by restriction analysis and DNA sequencing. Then transfected into HeLa cells. The functional analysis is valued by 51Cr?release assay. Results  HPV18 E2 gene fragment was amplified by PCR and ligated to pIRES2?EGFP, then transfected into HeLa cells successfully. The expression of green fluorescence cells was observed by fluorescence microscopy. The specific lysis of the cells from the three peptides was 60.00%, 71.29% and 80.00%. Conclusion  The three peptides have the ability to active epitope?specifical CTL. Based on them, a new peptides vaccine maybe constructed.

    Keywords: human papillomavirus type18; E2 gene; polypeptide

    宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。宫颈癌的发生可能与性生活紊乱，过早性生活，早年分娩，多产，地理环境等因素有关。分子生物学研究结果显示90%以上的宫颈癌伴有人乳头瘤病毒(HPV)感染。宫颈癌以鳞状细胞癌最为多见，其次为腺癌和腺鳞癌等。高危型HPV的感染是诱发宫颈癌的必要条件，尤其是HPV16型和18型。E2是一种反式激活蛋白，涉及病毒DNA转录的反式激活，能延缓染色体有丝分裂的进程，具有抑制癌细胞生长的功能。本实验是以加强绿色荧光质粒pIRES2?EGFP为载体，构建了HPV18E2蛋白的真核表达质粒pIRES2?HPV18E2?EGFP，为制作宫颈上皮内瘤变的性多肽疫苗打下基础。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    菌株：E.coli DH5 (由本实验室保存)。质粒：①pBR322/HPV18，含目的基因的重组质粒，由德国癌症研究中心E?M de Villiers教授惠赠；②pIRES2?EGFP：含绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体，Clontech公司，由Professor Roger Y. Tsien（University of California, San Diego, U.S.A）惠赠，含有Kan+抗性基因。HeLa细胞株，购自协和医科大学基础医学研究所。主要试剂：pfu高保真DNA聚合酶(上海生物工程公司)；质粒抽提试剂盒(Omega公司，美国)；DNA凝胶回收试剂盒(上海华舜生物有限公司)；BamH I、EcoR I内切酶(大连TaKaRa公司)；T4DNA连接酶试剂盒(大连TaKaRa公司)；DL2000 Marker(大连TaKaRa公司)；DL15000 Marker(大连TaKaRa公司)；PCR克隆引物(上海生物工程公司)，上游引物：5’?CGGAATTCATGGA

    GACTCTTTGCC?3’；(下划线部分为BamH I酶切位点，5’端为保护性碱基)，下游引物5’?CGGAATTCATGCAGACACCGAAGC?3’(下划线部分为EcoR I酶切位点，5’端为保护性碱基)；Gene Jammer Transfection Reage(Stratagene公司，美国)；质粒中量抽提试剂盒(Omega公司，美国)；DMEM培养基(Hyclone，美国)；胎牛血清(四季青公司，)；HEPES(GIBCO公司，美国)；胰蛋白酶(Sigma公司，美国)。

    1.2  实验方法

    pIRES2?HPV18E2?EGFP重组质粒的构建及质粒DNA转染HeLa细胞。外周血单个核细胞的分离及经典51Cr释放实验。

    2  结果

    2.1  重组质粒酶切鉴定结果

    质粒pIRES2?HPV18E2?EGFP经BamH I和EcoR I双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳。重组质粒双酶切在DL2000 Marker 1 000 bp条带稍靠后处出现两条特异性条带，应分别为载体片段和目的片段，初步证明构建正确(图1)。

    图1  重组质粒pIRES2?HPV18E2?EGFP酶切产物电泳

    2.2  重组质粒DNA序列测定

    质粒pIRES2?HPV18E2?EGFP由重庆医科大学分子生物学实验室测序。测序结果与NCBI公布的HPV18E2基因对比表明，插入的基因序列与HPV18E2基因序列正确吻合，表明重组质粒成功，命名为pIRES2?HPV18E2? EGFP。

    2.3  HeLa细胞pIRES2?HPV18E2?EGFP绿色荧光蛋白的表达

    转染后第4天加入G418进行筛选，在G418终浓度为600 mg/L时，细胞大量死亡，仅余少量贴壁细胞成活。维持此筛选浓度，培养基血清浓度改为20%，再筛选7 d后，荧光显微镜下见成活的贴壁细胞中，带有荧光的明显增多，约占细胞总数的50%(图2)。由于表达报告基因的细胞必然同时表达目的基因，转染成功的同时已成功构建表达HPV18E2蛋白的靶细胞模型。

    2.4  特异性CTL杀伤效能的检测

    经三条备选肽段刺激后得到的CTL具有明显的表位特异性杀伤能力。随着CTL与靶细胞比例(效靶比)的增加，靶细胞溶破率亦不断升高。而无关肽刺激得到的CTL在与靶细胞的反应中，未体现出明显的杀伤效果，当效靶比为12.5∶1、25∶1和50∶1时特异性杀伤率均小于5%，而在效靶比为100∶1时，也仅为2.7%，远远小于备选肽段的特异性杀伤率（图3）。

    在效靶比为12.5∶1、25∶1和50∶1时，三条肽段刺激得到的CTL杀伤效应没有明显的区别，而在效靶比为100∶1时，肽段3诱导得到的特异性CTL杀伤效应明显高于肽段2，而肽段2又明显高于肽段1，三者的特异性杀伤率从高到低依次为60.00%、71.29%和80.00%，都具有明显的杀伤效应，说明三条备选肽段均为HPV18E2蛋白的有效CTL表位。

    3  讨论

    HPV18E2蛋白编码基因序列位于HPV18基因组第2 817至3 914位，其蛋白由365个氨基酸构成［1］。E2是一种反式激活蛋白，涉及病毒DNA转录的反式激活。而且E2能延缓染色体有丝分裂的进程［2］。在HPV相关的恶性肿瘤中，病毒DNA常整合到宿主染色体中。相比之下，在癌前病变及宫颈上皮内瘤样变中却很少有整合。整合形式的HPV才具有恶性转化能力，因为HPV?DNA控制了宿主基因物质而产生HPV编码的蛋白。因此，整合常被认为是癌前病变转变为癌的激活机制之一［3］。HPV中的16型和18型是引发宫颈癌的主要型别。有研究发现HPV18感染在腺癌及腺鳞癌中更常见［4］。而且更易发生骨盆淋巴结转移和间质浸润，复发率也相对较高［5］。整合HPV18基因到宿主细胞后对癌的发生起决定性作用。其基因编码两种蛋白E1及E2。E2能结合HPV的早期启动子，从而抑制E6、E7转录。高危型HPV感染宫颈上皮后，病毒组DNA整合到染色体中，其E6和E7基因产物的持续表达，是诱发宫颈癌的主要原因［6］。因此，E2失去表达后将导致病毒癌基因的激活。在HPV18感染的细胞株中E2处于灭活状态，E2的功能即是抑制癌的发展［7］。将E2导入HPV感染的癌细胞中将抑制细胞生长，使其细胞周期停在G1期，衰老及凋亡。E2蛋白作为病毒DNA复制和基因表达的主要调控蛋白，在感染早期的病毒复制阶段和宫颈上皮内瘤变Ⅰ期(CINⅠ)高表达。这是因为在宫颈上皮瘤后期病变和高恶性度的宫颈癌中，病毒基因组线性化整合入人基因组中时，E2基因已经发生了断裂［8］。最近也有研究发现，机体针对HPV16之E6、E7蛋白的细胞免疫在有些时候并不能彻底清除HPV感染的细胞，说明机体对高危型HPV病毒（HPV16、HPV18）E6、E7蛋白的反应与病变的自行消退没有必然联系。Brandsma发现在兔乳头瘤（cottontail rabbit papillomavirus，CRPV）模型中，表达HPV E2的腺病毒疫苗能清除HPV的感染［9］。由此本文认为，E2蛋白将是一个新的性靶蛋白。现阶段有关E2基因的疫苗已在宫颈上皮内瘤变中取得了初步的研究进展［10］。HeLa细胞是宫颈癌细胞株系，因整合HPV18 E2基因而永生化。在本文的研究中，体外刺激外周血单个核细胞(PBMC)，诱导表位特异性CTL时，加入表位肽的同时也加入了rhIL?2，培养2周后见到明显的淋巴细胞增殖。在实验的最后结果中，肽段1、2、3的溶破率分别为60.00%、71.29%和80.00%，都具有明显的杀伤效应，说明三条备选肽段均为HPV18E2蛋白的有效CTL表位。也为以后宫颈上皮内瘤变的治疗性多肽疫苗研制打下基础。

【】
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