大鼠腹部开放伤海水浸泡后胃黏膜氨基己糖和磷脂的变化

         作者：朱雄伟 施文兴 湛先保 王强 仇明 胡志前 李兆申

  【摘要】目的：探讨大鼠腹部开放伤后海水浸泡的胃黏膜中氨基己糖和磷脂的改变。方法：32只SD大鼠随机分成正常对照组和腹腔浸泡伤1h、2h、3h 4组，分别取相应大鼠的胃黏膜，采用化学比色法和改良抗坏血酸法测定胃黏膜中氨基己糖和磷脂含量。结果：与正常组大鼠相比，腹腔浸泡伤组大鼠胃黏膜氨基己糖和磷脂随着浸泡时间的延长而进行性减低（P＜0.05）,并在3h时达最低。结论：海水浸泡伤是一损伤性因素，通过减低胃黏膜中氨基己糖和磷脂含量而损害腹腔浸泡伤的大鼠胃黏膜屏障。

    【关键词】海水・腹部损伤・胃粘膜・氨基己糖・磷脂类・大鼠，Spragedawley

     The changes of hexosamine and phospholipids in gastric mucosa of rats with seawater immersion after open abdominal trauma

       【ABSTRACT】Objective:To explore the changes of hexosamine and phospholipids in gastric mucosa of rats with open abdominal trauma after seawater immersion.Methods:Thirtytwo rats were randomly divided into four groups(normal control group,celiac seawaterimmersing trauma stress 1,2,3h groups).The amount of hexosamine and phospholipids in gastric mucosa of rats were detected by both chemochromometric and modified chemical methods.Results:Compared with normal rats,both hexosamine and phospholipids in gastric mucosa of rats under celiac seawaterimmersing trauma are progressively decreased(P0.05),especially in stress 3h group.Conclusion:Seawater immersing trauma is a harmful factor,it deteriorates gastric mucosal barrier in rats with open abdominal trauma after seawater immersion through lowering the content of hexosamine and phospholipids.

    【KEY WORDS】Seawater・Abdominal injuries・Gastric mucosa・Phospholipid・Rats,Spraguedawley    急性胃黏膜病变（acute gastric mucosal lesion,AGML）是创伤后最为常见的内脏并发症之一，一旦合并大量出血，处理非常困难，死亡率高，严重威胁病人的生命。在海战和渡海登陆战争中，由于特殊的战争环境，海水进入受伤开放性腹腔内的情况会时有发生。我们以前的实验［1］证实，海水浸泡伤后胃黏膜可发生AGML。本实验检测了AGML磷脂和氨基己糖的改变，为海水浸泡伤的早期综合救治提供新的思路。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物分组和模型制作  SD大鼠（第二军医大学动物中心提供）32只，体重200~300g，清洁级，雌雄各半，随机分为4组：0h组（正常组），腹腔开放伤浸泡人工海水组分为1h、2h、3h3组。模型制作参照［1］进行。为消除生物节律对实验结果的影响，均于上午8时开始实验。造模前禁食24h，自由饮水，实验前1h禁水。

    1.1.2  实验仪器  台式低温高速冷冻离心机、DHG9070型电热恒温鼓风干燥箱、水浴锅、822型恒温磁力搅拌器、UV754型紫外可见光光度计、煮沸锅、XHF1型高速组织匀浆器、震荡器。

    1.2  主要试剂

    1.2.1  人工海水配置  根据国家海洋局第三研究所提供的配方配置，主要指标：渗透浓度（1250±11.52）mmol/L,pH8.2,Na+浓度（630±5.33）mmol/L,K+浓度（10.88±0.68）mmol/L，Cl1浓度为（658.8±5.25）mmol/L,温度（21±2）℃。

    1.2.2  试剂  1.0mg/ml标准牛血清蛋白溶液，蛋白染色液，2mol/L的Na2CO3,40ml/L乙酰丙酮溶液，0.1mg/ml的盐酸氨基葡萄糖标准液，对二甲氨基苯甲醛试剂。8.0ml/L盐酸溶液，8.3mol/L的NaOH溶液，抽提液，消化剂，显色剂，1mg/ml磷贮存液，0.04mg/ml磷应用液。

    1.3  胃黏膜中氨基己糖和磷脂的测定

    1.3.1  胃黏膜标本的制备  用玻片将新鲜腺胃部胃黏膜组织轻轻刮下，低温冷冻后称重，取1/2置于2ml生理盐水中，研碎成匀浆，离心取上清液，分别用于测定蛋白和磷脂、氨基己糖。

    1.3.2  考马斯亮蓝G250染色法制作蛋白标准曲线。按表1操作，室温放置15min后于595nm处比色测定，每组重复3次测定标本中蛋白含量。表1  考马斯亮蓝G250染色法测定蛋白含量

　　1.3.3  大鼠胃黏膜中氨基己糖含量测定  参照冯敬池等［2］报道的方法进行。氨基己糖（μg/mg蛋白）=匀浆上清液氨基己糖（μg/L）/蛋白质浓度（mg/L）。精密称取105℃干燥恒重的盐酸氨基葡萄糖50mg溶解于500ml去离子水中配置成0.1mg/ml的盐酸氨基葡萄糖标准液。制备标准曲线：在试管中分别加入0.1mg/ml的盐酸氨基葡萄糖标准液0.25,0.5,0.75,1.0,1.25ml，分别加水至2.5ml，加乙酰丙酮0.5ml，置沸水浴25min，冷水中迅速冷却，各加无醛乙醇1.5ml及对二甲氮基苯醛0.5ml，震荡，置60℃水浴保温1h，空白用2.5ml去离子水代替标准样品液，530nm波长处测定OD值。

    1.3.4  海水浸泡伤大鼠胃黏膜中磷脂含量测定  取0.1ml黏液匀浆液加入磨砂口刻度试管中，加无水乙醇乙醚提取液2.4ml，取1ml上清液加入15mm×150mm试管中，在沸水浴上将溶剂蒸发至干，加消化液0.2ml。另外取两管作为空白管和标准管，空白管加去离子水，标准管加磷应用液0.1ml，分别加入消化液0.2ml。震荡器剧烈快速振摇3min，室温下放置10min后离心2000r/min×15min，将3管都放在铁丝架上，直接在1000W电炉上加热5~8min，见测定管内颜色先变棕黑色后变澄清时即可从电炉上取下，冷却后各管内加入显色剂2ml，60~70℃水浴10min（37℃需要2h显色完全），冷却后在700nm闭塞测定OD值。

    磷脂含量（mmol/L）=（测定管光吸收度/标准管光吸收度）×磷标准浓度（0.04mg/ml）×1000×磷标准液体积（μl）/磷分子量（30.97）×提取液（μl）×匀浆液（ml）。

    1.3.5  统计学分析  实验数据以x±s表示，组间差异采用t检验。

    2  结  果

    2.1  蛋白标准曲线  见图1。图1  考马斯亮蓝法测定蛋白标准曲线

    2.2  盐酸葡萄糖胺的标准曲线  见图2。 图2  盐酸葡萄糖胺的标准曲线

    2.3  海水浸泡伤大鼠胃黏膜中氨基己糖和磷脂的变化  见表2。与对照相比，海水浸泡伤1h、2h及3h组大鼠胃黏膜氨基己糖的含量显著降低（P＜0.01），以海水浸泡伤3h组降低最明显（P＜0.01）。与对照组相比，海水浸泡伤1h、2h及3h组大鼠胃黏膜磷脂的含量显著降低（P＜0.01），以海水浸泡伤3h组降低最明显（P＜0.01）。表2  海水浸泡伤大鼠胃黏膜中氨基己糖和磷脂的变化

　　3  讨  论

    AGML系指机体在严重创伤、感染、休克等应激状态下，发生以胃黏膜损害为主的病理改变和上消化道出血为特征的临床病症，从病的角度，将各种应激因素引起的急性胃黏膜损害和浅表性溃疡统称为AGML更为合适。在海上战事中，腹部开放伤是一种较为常见的伤型，其发生率约为4%［3］。研究发现，腹腔海水浸泡可直接导致组织细胞的损伤，引起机体发生多器官功能障碍综合征［4］。

    胃黏膜细胞保护机制与强固胃黏液碳酸氢盐屏障、增强胃黏液屏障、增加胃黏膜血流量、促进胃黏膜更新、稳定溶酶体及维持黏膜巯基化合物含量、增加胃黏膜表面活性磷脂的分泌、减慢胃动力、清除氧自由基、抑制白三烯形成、维持迷走神经功能完整性等有关。胃壁屏障在解剖上分为胃黏液屏障与胃黏膜屏障两部分。胃黏膜表面约0.25~0.5mm厚的非水溶性凝胶样黏液层构成胃黏液屏障，具有润滑作用，在消化运动过程中保护胃黏膜免受机械性损伤；更重要的是与HCO3-一同构成黏液HCO3-屏障，以中和胃酸，使黏液层表面与深层保持巨大的pH反差。黏液成分95%为水，其它是多聚糖蛋白、电解质、肽、脂质等。糖蛋白的组成成分有N乙酰氨基己糖、半乳糖、N乙酰氨基半乳糖和岩藻糖，而N乙酰氨基己糖含量占23.6%，氨基己糖可间接反映黏液糖蛋白的含量，故氨基己糖水平被认为是衡量胃黏膜重要防御因子糖蛋白含量的重要指标。

    哺乳动物的胃黏膜表面有疏水性，可阻止H+向黏膜内逆向弥散。磷脂是构成黏膜疏水性的主要特征，测定其含量变化可反映胃黏膜表面疏水性的变化。胃黏膜表面磷脂的主要成分为卵磷脂和磷脂乙醇胺，由黏液细胞分泌，当被分泌到胃黏膜表面则与糖蛋白复合物一起构成胃黏膜和黏液屏障，使上皮具有疏水性，有效地抑制H+向黏膜内弥散。抗H+通透性效率以磷脂最强［5］。

    黏液的黏滞性和凝聚性与糖蛋白和磷脂有关。胃黏液屏障要维持其功能，必须确保正常的氨基己糖和磷脂含量。本实验通过测定氨基己糖与磷脂来了解海水浸泡伤对胃黏膜黏膜黏液屏障的破坏。结果显示：与对照组相比，海水浸泡伤1h、2h及3h组大鼠胃黏膜中氨基己糖与磷脂的含量均明显降低（P＜0.01），胃黏膜损伤程度随着应激时间的明显延长而呈明显加重趋势，以海水浸泡伤3h组最为明显。氨基己糖与磷脂的降低均伴有胃黏膜病变程度的加重，且两者有明显的负相关，提示胃黏膜疏水性的降低可能参与了AGML的发生。它可能是通过机体体液或者神经途径作用于上皮细胞影响磷脂的合成或分泌，也可能为促使其降解所致。

    综上所述，海水浸泡伤作为一种严重的应激状态，可使胃黏液凝胶内磷脂含量的降低，使胃黏膜的疏水性进行性降低，H+通透性升高，导致AGML的发生，氨基己糖与磷脂的测定值表明，黏液屏障的损伤与黏膜病变的加重及改善相互影响、互为因果，因此可以通过提高胃黏液氨基己糖与磷脂含量加强黏液屏障，从而修复胃黏膜损伤。

    参  考  文  献

    ［1］朱雄伟，王强，湛先保，等.开放性腹腔海水浸泡伤后大鼠急性胃黏膜病变模型的建立［J］.医学杂志，2004，14（21）：4547.

    ［2］冯敬池，冯丽英，宫心鹏.胃黏膜氨基己糖测定方法的研究及临床应用［J］.陕西医学检验，2001，16（4）：2224.

    ［3］赖西南，王丽丽.海上及登陆作战的战伤救治［J］.人民军医，2000,43（9）：498499.

    ［4］王育红，鹿尔驯，虞积耀，等.腹部开放性损伤犬经海水浸泡后血液动力学及病理学的变化［J］.中华外科杂志，2000，38（9）：700702.

    ［5］Slomiany BL,Slomiany A.Secretion of gastric mucus phospholipids in response to betaadrenergic G proteincoupled receptor activation is mediated by SRC kinasedependent epidermal growth factor receptor transactivation［J］.J Physiol Pharmacol,2004,55(3):627638.