激活LXR对海马神经元神经甾体合成的促进作用

            作者：张淑坤，杨荣慧，张翠欣， 姜玲玲，侯艳宁 

【摘要】  目的： 研究肝X受体（LXR）激活对海马神经元神经甾体合成的影响. 方法：将大鼠海马神经元体外培养至第7日，在培养液中加入2.0 μmol/L TO901317，继续培养48 h. 应用高效液相?质谱联用（HPLC?MS）分离测定培养液中游离型神经甾体孕烯醇酮（PREG）、脱氢表雄酮（DHEA）和结合型神经甾体孕烯醇酮硫酸酯（PREGS）、脱氢表雄酮硫酸酯（DHEAS）的含量；RT?PCR方法观察海马神经元P450侧链裂解酶（P450scc）、甾体合成快速调节蛋白（StAR）和3β?羟基甾醇脱氢酶（3β?HSD）等神经甾体合成关键酶基因的mRNA的表达. 结果： TO901317激活LXR，促进P450scc，StAR和3β?HSD的mRNA表达，增加海马神经元培养液中神经甾体PREG，DHEA，PREGS和DHEAS含量. 结论： LXR激活时，可通过上调海马神经元 P450scc，StAR和3β?HSD的mRNA表达，促进神经甾体的合成.

【关键词】  肝X受体；P450侧链裂解酶；神经甾体；海马, 神经元

　　【Abstract】AIM:  To investigate the effect of liver X receptor (LXR) activation on the synthesis of neurosteriod in hippocampal neurons. METHODS:  On day 7 of culture, hippocampal neurons were treated with 2.0 μmol/L TO901317 dissolved in dimethylsulfoxide for 48 h. The mRNA expressions of P450 side chain cleavage (P450scc), steroidogenic acute regulatory protein (StAR) and 3β?hydroxysteroid dehydrogenase (3β?HSD) were measured by RT?PCR and the contents of unconjugated neurosteriods pregnenolone(PREG), dehydroepiandrosterone(DHEA) and conjugated neurosteroids pregnenolone sulfate(PREGS), dehydroepiandrosterone sulfate(DHEAS) in medium were analyzed and determined using high?performance liquid chromatography?mass spectrometry (HPLC?MS). RESULTS: Incubation of hippocampal neurons with TO901317 significantly increased the expressions of P450scc, StAR and 3β?HSD mRNA and the levels of PREG, DHEA, PREGS and DHEAS. CONCLUSION: Activation of LXR contributes to the synthesis of neurosteriod by up?regulating the expressions of P450scc, StAR and 3β?HSD in hippocampal neurons.

　　【Keywords】 liver X receptor; P450 side chain cleavageenzyme; neurosteroid; hippocampus; neurons

　　0引言

　　中枢神经系统的胆固醇在甾体合成快速调节蛋白（StAR）的引导下被转运到线粒体内膜，然后由P450侧链裂解酶（P450scc）催化生成孕烯醇酮（PREG），后者在3β?羟基甾醇脱氢酶（3β?HSD）等的催化下转化成脱氢表雄酮（DHEA），PREG和DHEA在磺基转移酶的催化下生成结合型神经甾体孕烯醇酮硫酸酯（PREGS）和脱氢表雄酮硫酸酯（DHEAS），发挥生物效应. 体外培养海马神经元和小鼠阿尔茨海默病（AD）模型均表明，用人工合成配体TO901317激活肝X受体（LXR）能增加其下游基因ATP结合盒转运体A1（ABCA1）的表达，阻止AD发生 ［1-2］. 本实验旨在观察LXR激活时对海马神经元神经甾体的合成和分泌有何影响.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　DMEM、优级胎牛血清（Hyclone公司）；L?左旋多聚赖氨酸、阿糖胞苷、二甲基亚砜、TO901317（Sigma公司）；胰蛋白酶（Gibco公司）；Trizol（美国Invtrogen公司）；逆转录试剂盒（美国Promega公司）；pfu DNA聚合酶（北京Tiangen公司）；Agilent液相色谱?质谱联用仪 ［HP1100自动进样器、大气压化学离子源 (APCI)及四极杆质谱检测器］；神经甾体标准品（Sigma公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1海马神经元原代培养及处理采用［3］的方法，并稍加以改动. 取当日新生Wastar大鼠，750 mL/L 乙醇消毒，取出完整脑组织置于DMEM中，钝性分离海马并去除血管和脑膜，将海马剪成1 mm×1 mm×1 mm小块，1.25 g/L胰蛋白酶，37℃消化25 min. 等体积种植液即含100 mL/L胎牛血清和1×105 U/L青、链霉素的DMEM终止消化5 min并洗涤1次. 用Pasteur吸管轻柔吹打25次左右获得单细胞悬液，调整细胞密度为5×108 /L，接种于预先L?多聚赖氨酸处理过的35 mm培养皿中. 置37℃，50 mL/L  CO2及饱和湿度的细胞培养箱培养. 培养至第3日改用含300 μg/L阿糖胞苷的饲养液（含50 mL/L优级胎牛血清和1×105 U/L青、链酶素的DMEM），作用24 h后去除. 培养至第7日，将所有神经元随机分为2组，每组6孔：处理组换含2.0 μmol/L TO901317（溶于DMSO）的饲养液，对照组换含等体积DMSO的神经元饲养液，继续培养48 h.

　　1.2.2海马神经元总RNA提取、RT?PCR细胞用预冷的PBS轻漂2遍，Trizol法提取总RNA. RT及PCR参照试剂盒说明，PCR引物由上海生工生物工程技术有限公司. 各待测基因退火温度、扩增产物长度见表1. 取内参照β?actin和待测基因PCR产物5 μL，20g/L琼脂糖凝胶电泳. 凝胶成像分析系统分析待测基因与β?actin PCR产物的光密度比值. 表1各基因的PCR引物序列、退火温度和产物长度基因（略）

　　1.2.3细胞培养液中神经甾体的提取和纯化采用本实验室固定方法［4］.

　　统计学处理：数据均用x±s表示. 应用SPSS 13.0软件进行成组设计的t检验，P＜0.05有统计学意义.

　　2结果

　　2.1LXR激活对海马神经元ABCA1 mRNA表达的影响与对照组相比，处理组海马神经元ABCA1 mRNA表达升高，两组差异有统计学意义［（0.251±0.059）和（0.603±0.046），t=-10.034，P＜0.01）］.

　　2.2LXR激活对海马神经元神经甾体合成关键酶P450scc、StAR和3β?HSD mRNA表达的影响与对照组相比，处理组P450scc，StAR和3β?HSD的 mRNA表达均升高，差异有统计学意义（P＜0.05，图1，表2）. 表2LXR激活对大鼠海马神经元P450scc，StAR和3β?HSD mRNA表达的影响（略）

　　2.3LXR激活对海马神经元培养液神经甾体含量的影响与对照组相比，处理组PREG，DHEA和PREGS，DHEAS的含量均增加，差异均有统计学意义（P＜0.05，表3). 表3LXR激活对大鼠海马神经元神经甾体分泌的影响（略）
 
　　3讨论

　　AD是一种神经退行性病变，特征性病理改变为β?淀粉样肽（β?amyloid peptide，Aβ）在细胞外沉积形成老年斑，海马是Aβ最早出现和病变最严重的主要脑区. Aβ具有神经毒性，所致的胆碱能系统损伤是AD认知功能障碍的重要决定因素. 神经甾体具有广泛的生物学作用，参与神经元的发育分化、突触的可塑性、神经递质的释放、学习与记忆等. Weill?Engerer等［5］的研究发现，AD患者各脑区的神经甾体水平均较正常人降低，且皮质结合型神经甾体PREGS和DHEAS含量与Aβ含量呈负相关，提示神经甾体水平降低在AD的发生中起重要作用. 在本实验中，我们检测到LXR激活后ABCA1 mRNA表达的上调，证实在体外培养的海马神经元TO901317能与LXR结合，并进一步激活其下游基因. 我们还发现，LXR激活后，海马神经元神经甾体合成的关键酶P450scc，StAR和3β?HSD的mRNA表达增加，游离型和结合型神经甾体的合成增多，说明LXR激活，上调海马神经元神经甾体合成关键酶P450scc，StAR和3β?HSD的mRNA表达，促进海马神经元神经甾体的合成和分泌.

　　大鼠海马神经元有P450scc，StAR和3β?HSD等神经甾体合成酶的表达，能以区域特异性的方式合成各种神经甾体. 其中结合型神经甾体PREGS和DHEAS是兴奋性神经甾体，能增强神经元的兴奋性和突触可塑性，促进动物的记忆获得和保持. PREGS是一种有效的记忆增进剂，能促进乙酰胆碱递质的释放，增强空间记忆，在老年大鼠海马中PREGS浓度的下降与学习记忆功能的丧失呈正相关［6］，而DHEAS是雄激素和雌激素的前体，可增强老年大鼠的学习和记忆，延缓脑衰老［7］. 我们的研究首次表明，LXR激活时，除了上调ABCA1 mRNA表达，促进细胞内胆固醇外流，降低海马神经元Aβ产生外，还通过上调P450scc，StAR和3β?HSD mRNA的表达来增加神经甾体的合成和分泌，从而增强学习能力，减缓记忆衰退，改善AD早期的认知功能障碍.  

【】
  　　［1］Koldamova RP, Lefterov IM, Staufenbiel M, et al. The liver X receptor ligand T0901317 decreases amyloid beta production in vitro and in a mouse model of Alzheimer?s disease［J］. J Biol Chem, 2005, 280: 4079-4088.

　　［2］Riddell DR, Zhou H, Comery TA, et al. The LXR agonist TO901317 selectively lowers hippocampal Abeta42 and improves memory in the Tg2576 mouse model of Alzheimer?s disease［J］. Mol Cell Neurosci, 2007, 34(4): 621-628.

　　［3］司徒镇强, 吴军正. 细胞培养［M］. 西安:世界图书出版公司, 2007: 119-121.

　　［4］张翠欣, 侯艳宁. 乙醇、乙醛对原代培养星形胶质细胞神经甾体合成的影响［J］. 药学杂志, 2006, 41(5): 395-398.

　　［5］Weill?Engerer S, David JP, Sazdovitch V, et al. Neurosteroid quantification in human brain regions: comparison between Alzheimer?s and nondemented patients［J］. J Clin Endocrinol Metab, 2002, 87(11): 5138-5143.

　　［6］Hige T, Fujiyoshi Y, Takahashi T. Neurosteroid pregnenolone sulfate enhances glutamatergic synaptic transmission by facilitating presynaptic calcium currents at the calyx of Held of immature rats［J］. Eur J Neurosci, 2006, 24(7): 1955-1966.

　　［7］Chen L, Miyamoto Y, Furuya K, et al. Chronic DHEAS administration facilitates hippocampal long?term potentiation via an amplification of Src?dependent NMDA receptor signaling［J］. Neuropharmacology, 2006, 51(3): 659-670.