人基质细胞衍生因子?1对骨髓间充质干细胞增殖的影响

                作者：孔霞, 唐俊明, 郭凌郧, 杨建业,陈龙,黄永章,王家宁

【摘要】  目的：探索人基质细胞衍生因子?1（SDF?1）对间充质干细胞（MSC）增殖的影响. 方法：采用经典的全骨髓贴壁法培养MSC, 通过成骨、成脂肪等多向诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记（CD133，CD34，CD90，CD105）等鉴定MSC特征；以P3?MSC为实验材料，采用H3?TdR参入法分析SDF?1对MSC增殖的影响. 以50 nmol/L渥曼青霉素，10 mmol/L LY294002，50 mmol/L PD98059，0.1g/L AMD3100等分别处理P3?MSC, 观察SDF?1影响MSC增殖的信号机制. 结果：培养的MSC呈现出CXCR4，CD90和CD105强阳性，具有成骨、成脂肪等多向分化能力；含有100 mg/L SDF?1的20 mL/L促进了MSC增殖，而含有100 mg/L SDF?1的150 mL/L FBS抑制了MSC增殖. SDF?1抑制MSC增殖的效应与其使MSC停滞在G1/S期有关. 促分裂原活化蛋白激酶P38MAPK阻断剂SB203580和CXCR4阻断剂AMD3100取消了SDF?1抑制MSC增殖的效应，而细胞外信号调节激酶阻断剂PD98059加强了SDF?1抑制MSC增殖的效应. 结论：SDF?1/CXCR4介导的抑制MSC增殖的效应与促分裂原活化蛋白激酶和细胞外信号调节激酶等信号分子有关.

【关键词】  人基质细胞源衍生因子?1; 间充质干细胞;增殖;促分裂原活化蛋白激酶

　　【Abstract】 AIM: To explore the effect of stromal cell?derived factor?1 alpha (SDF-1α) on mesenchymal stem cell (MSC) proliferation. METHODS: MSC culture was performed with the  classical whole bone marrow adhering method; MSC was identified through multi?differentiation and surface marker assay (CXCR4, CD133, CD34, CD90,CD105); After MSCs were treated with 100 mg/L SDF?1a, 50 nmol/L wortmannin, 10 mmol/L LY294002, 50 mmol/L PD98059 and 0.1 g/L AMD3100 inhibitors, the proliferation rates were measured by ［3H］?thymidine incorporation assay. RESULTS: Cultured MSCs had the ability of multi?differentiation and highly expressed CXCR4, CD105 and CD90. 20 mL/L FBS including 100 mg/L SDF?1a promoted MSC proliferation, however exposure of MSCs to 150 mL/L FBS including 100 mg/L SDF?1a could induce marked inhibition of MSC proliferation through the arrest in the G1/S checkpoint.  And its inhibitory effect on MSC proliferation was partly reversed by p38 mitogen?activated protein kinase （MAPK）  inhibitor SB203580 and CXCR4 inhibitor AMD3100. However its inhibition effect on MSC proliferation was obviously enhanced by extracellular signal?regulated kinase (ERK1/2) inhibitor PD98059.CONCLUSION: The effect of SDF?1a on MSC proliferation is related to ERK1/2 and p38 MAPK.

　　【Keywords】 hSDF?1α; mesenchymal stem cell; proliferation; MAPK

　　0  引言
   
　　骨髓来源的间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell, MSC）在一定条件下可以分化为心肌、成骨、软骨、脂肪、胰岛、肌腱等多种类型的细胞［1］. 在心肌内、静脉内、冠脉内等不同途径移植MSC或粒系集落刺激因子动员骨髓发现其可以迁移到心肌梗死部位，通过参与血管新生、心肌再生等改善修复受损的心脏［1］. 有研究［2］发现，SDF?1/CXCR4轴不仅调控造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）的迁移，而且也影响HSC的增殖和分化. 新近研究发现MSC表达CXCR4［3］，显示SDF?1/CXCR4轴可介导MSC的迁移［4］. 但是就SDF?1/CXCR4轴是否影响MSC的增殖分化，目前仍不清楚. 我们利用H3?TdR参入法检测SDF?1α对MSC增殖的影响，并初步探索SDF?1α影响MSC增殖的信号机制.

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  SPF级WISTAR大鼠3只,体质量(230±20) g. 动物在屏障系统环境下，用专用饲料和灭菌水分笼饲养. 动物合格证号为SCXK(鄂)?2003?005，实验动物使用许可证号为SYXK(鄂)?2004?021（均由湖北省实验动物中心提供）. DMEM培养基（美国Gibcol公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，杭州四季青生物工程有限公司）；胰酶（美国Sangon公司）；CO2细胞培养箱（美国仪器公司）；倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)；恒低温切片机(德国Leica公司)；图像分析系统（美国Media Cybernetics公司）；hSDF?1α（美国upstate公司）；CD105, CD90, CD133和CD34（美国eBioscience公司）；地塞米松、β?磷酸甘油、维生素C、胰岛素、4，6?联脒?2?苯基吲哚（4,6?diamidino?2?phenyl?indoledi?acetate,DAPI)、SDF?1特异性受体CXCR4阻断剂AMD3100，  0.1 g/L(美国Sigma公司)；hSDF?1a(美国Upstate公司)；磷酰肌醇?3激酶(phosphatidylinositol 3?kinase, PI3K)阻断剂, 渥曼青霉素（50 nmol，美国Alexis biochemicals公司）；丝裂原活化蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase, MAPK）阻断剂PD98059（50 mmol，美国eBioscience公司）.

　　1.2  方法

　　1.2.1  MSC的培养［1］  采用全骨髓法. 给予大鼠腹腔注射肝素5000 U,15 min后断颈处死, 收集双侧胫股骨中全骨髓. 按1×109细胞/L接种于75 cm2培养瓶，24 h后换液,去除未贴壁的细胞. 以后3～4 d 完全换液1次，12～14 d 后细胞密度达80%～90%，用2.5 g/L的胰酶消化后1∶3传代, 记为P1代MSC(P1?MSC). 随后按上述方法传代培养. 培养的P3?MSC中加入终浓度为50 mg/L的DAPI温育1 h，荧光显微镜下观察其DAPI标记的效率为100%［1］. 消化收集P3代的MSC(P3?MSC)，制成1×109/L细胞悬液，以备迁移实验. 细胞培养条件：含150 mL/L的FBS以及1×105/L青霉素、100 mg/L链霉素和0.25 mg/L两性霉素B的DMEM培养基，37℃ 50 mL/L CO2饱和湿度.

　　1.2.2  MSC的鉴定

　　1.2.2.1  成骨诱导  P3?MSC培养至90％融合后6孔板加入成骨诱导液(150 mL/L FBS?DMEM,含地塞米松4×10-6 g/L, β?磷酸甘油1 g/L, 维生素C 0.5 g/L)，每72 h换液，诱导2  wk. Von Kossa?s染色鉴定矿化结节.

　　1.2.2.2  成脂肪诱导  P3?MSC培养至90％融合后6孔加入成脂肪诱导液(10 mg/L胰岛素), 每72 h换液. 苏丹Ⅲ染色鉴定脂肪细胞.

　　1.2.2.3  流式细胞术鉴定MSC表面标记特征  用1 mL注射器将MSC（密度为1010/L）吹打混匀后，取600 μL（至少含有2×106个细胞），等分为4份，分别加入4个Eppendorf管中. a管为标准对照，加入4 μL大鼠IgG1?FITC及4 μL大鼠IgG1?PE mAB（荧光二抗）；b管加入4 μL CD34?FITC和4 μL CD133?PE mAB（一抗）；c管加入4 μL CD90 mAb（一抗）；d管加入4 μL CD105 mAB（一抗），4℃下避光孵育40 min，洗涤液1000 r/min离心5 min，用PBS洗1～2 次. 在c, d管中加入8 μL大鼠IgG1?FITC（荧光二抗），4℃下避光孵育20 min. 洗涤液洗2次. 加入固定液1 mL，上流式细胞仪(Beckman Coulter)检测表面标志，应用Cotfit软件分析结果.

　　1.2.2.4  免疫组化鉴定MSC表面标记特  于24孔板中培养P3?MSC至90％融合后，PBS洗3次，40 g/L多聚甲醛固定15 min. 羊血清封闭2 h，加小鼠抗大鼠CD105，小鼠抗大鼠CD90和兔抗大鼠CXCR4等一抗4℃孵育过夜. PBS洗3次，分别加羊抗小鼠和羊抗兔绿色荧光二抗室温孵育2 h. PBS洗3次，PBS甘油（50%∶50%,封片）. 荧光显微镜下观察成像分析.

　　1.2.3  H3?TdR参入法分析MSC增殖  取24孔培养板，向每孔内加入2.5×104 P3?MSC培养（150 mL/L FBS）24 h，20 mL/L FBS培养24 h. 随后分别给予不同处理即：150 mL/L FBS+100 mg/L SDF?1，20 mL/L FBS+100 mg/L SDF?1和150 mL/L FBS. 分别浓度为3.7×1010 Bq/L （1×103 uCi/L）的3H?TdR 0.1 mL，混匀后分别培养0.5, 1, 12, 24和48 h. PBS漂洗细胞3次，甲醛固定10 min. 于4℃ 50 mL/L三氯醋酸漂洗3次. 每孔加入0.5 mL 0.3 mol/L NaOH 60℃水浴处理30 min，冷却至室温. 收集上述裂解液移入闪烁瓶中，加入5 mL闪烁液，用液体闪烁计数器计数每分钟的闪烁次数（cpm）, 测定DPM值，反映细胞DNA合成速率. 每组重复3次. 在上述基础上，分别给予P3?MSC不同处理即：PI?3K抑制剂渥曼青霉素、ERK1/2阻断剂PD98059(50 mmol/L), p38MAPK阻断剂SB230580(30 mmol/L)和CXCR4阻断剂AMD3100(0.1 g/L). 其它按上述方法执行.

　　1.2.4  细胞周期的测定  取24孔培养板，向每孔内加入2.5×104 P3?MSC培养（150 mL/L FBS）24 h，20 mL/L培养24 h. 随后分别给予不同处理即：150 mL/L FBS+100 mg/L SDF?1，20 mL/L FBS+100 mg/L SDF?1和150 mL/L FBS. 分别于处理后培养0.5, 1, 12, 24和48 h胰酶消化收集细胞,制成单细胞悬液. 700 mL/L乙醇固定细胞过夜,5 g/L的RNA酶常温消化细胞15 min. 25 mg/L的PI染料4℃避光处理细胞15 min. 随后流式细胞仪检测分析细胞周期,记录静止期与DNA合成前期(G0/G1)细胞比例.

　　2  结果

　　2.1  MSC的培养  由于造血干细胞不贴壁生长, 经过数次换液, 悬浮的造血干细胞逐渐被清除, 贴壁MSC呈匀一梭形成纤维细胞样形态. 呈集落生长,增殖迅速. 原代MSC潜伏期约2～4 d,对数生长期3～5 d,此后进入平台期. 传代MSC潜伏期较短,约1～2 d, 对数生长约3～4 d,可连续传4～6代. 一般原代细胞4～5 d可传代,传代细胞2～3 d可再次传代.

　　2.2  MSC的鉴定  MSC具有成骨成脂肪等多向分化潜能（图1）. 流式分析表明MSC低表达CD34（1.5%）, CD133（1.8%）；高表达CD90（96.0%）, CD105（97.0%）. 免疫组化分析结果显示，MSC可高表达CD90, CD105和高表达SDF?1受体CXCR4（图2）.

　　A: MSCs诱导分化为脂肪细胞  ×200; B: MSCs诱导分化骨细胞  ×100.

　　图1  MSCs成骨成脂肪诱导分化（略）

　　A: MSC表达CXCR4； B： MSC表达CD105； C： MSC表达CD90.

　　图2  MSC表面特征免疫组化检测结果  SP ×200（略）

　　2.3  SDF?1对MSC增殖的影响  在SDF?1α处理后不同时间点，100 mg/L SDF?1对MSC增殖的影响与血清浓度密切有关，其中含100 mg/L SDF?1的20 mL/L FBS促进MSC增殖，而含100 mg/L hSDF?1的150 mL/L FBS抑制MSC增殖（图3）.

　　A: MSC表达CXCR4； B: MSC表达CD105. aP<0.05 vs 150 mL/L FBS组和含100 μg/L SDF?1的150 mL/L FBS组; cP<0.05 vs 150 mL/L FBS和含100 μg/L SDF?1的20 mL/L FBS组.
　　
　　图3  SDF?1对MSC增殖的影响（略）

　　2.4  SDF?1影响MSC增殖的信号机制  在不同阻断剂处理后不同时间点，PI3K阻断剂渥曼青霉素和LY294002, ERK1/2阻断剂PD98059加强了SDF?1对MSC增殖的抑制作用，而SDF?1特异性受体CXCR4阻断剂AMD3100, p38MAPK阻断剂SB230580部分取消了SDF?1对MSC增殖的抑制作用（图4）.

　　aP<0.05 vs 150 mL/L FBS组,含100 μg/L SDF?1的150 mL/L FBS组,ERK1/2阻断剂PD98059处理组和PI3K?AKT阻断剂渥曼青霉素处理组.

　　图4  SDF?1影响MSC增殖的信号机制（略）

　　2.5  SDF?1对MSC细胞周期的影响  100 mg/L SDF?1处理MSC后不同时间点，G0/G1期的MSC明显增多, 且呈现出时间依赖的关系（图5）.

　　3  讨论
   
　　近年来，许多学者研究SDF?1/CXCR4轴介导HSC动员迁移的信号分子机制发现：利用PI?3K?AKT途径抑制剂Ly290042或渥漫青霉素等时可明显抑制HSC的迁移 ［5-9］. 同时从SDF?1/CXCR4轴对HSC增殖分化的研究认识到，SDF?1对HSC的幸存能力、增殖的调节主要与PI?3K?AKT, ERK1/2等信号转导通路有关［6-7］. SDF?1/CXCR4轴介导MSC迁移的机制与HSC非常相似.

　　aP<0.05 vs 150 mL/L FBS组和含100 μg/L SDF?1的150 mL/L FBS组; cP<0.05 vs 150 mL/L FBS和含100 μg SDF?1的20 mL/L FBS组.

　　图5  SDF?1对MSC细胞周期的影响（略）

　　本研究选用具有多向分化潜能的MSC作为实验材料，并采用最新的鉴定MSC的标准［10］. 同时利用免疫细胞化学的方法进一步确认MSC表达SDF?1受体CXCR4. 采用H3?TdR参入法分析SDF?1对MSC增殖的影响. 研究结果发现2% FBS和SDF?1处理后促进了MSC的增殖，15% FBS和SDF?1处理后抑制了MSC的增殖. 前者与Kortesidis等［11］报道的一致，后者存在差异，主要与MSC培养体系不同有关. 其原因在于: ① 实验体系不同. 即Kortesidis等采用的是无血清的多种细胞因子组合诱导MSC增殖的培养体系，而我们为有血清的培养体系；② 评价增殖的方法不同. 即Kortesidis等［11］采用的是MSC克隆形成法（CFU?F）评价，而我们采用的是H3?TdR参入法分析MSC增殖；③ 实验材料不同. 即Kortesidis等［11］采用的人MSC，而我们采用的是大鼠MSC. 这些结果一方面提示血清中复杂的成分在MSC增殖过程发挥着重要作用，另一方面提示当加入外源性诱导因子如SDF?1后，与血清中的诱导因子交互作用而导致MSC增殖呈现出不同的效应.
   
　　在此基础上，我们进一步分析SDF?1对MSC增殖影响的信号机制发现：CXCR4阻断剂阻断SDF?1/CXCR4对MSC的作用后，其抑制增殖的效应几乎被取消，表明SDF?1具有抑制MSC增殖的作用，并且这种作用与其受体CXCR4有关. 已知SDF?1与其受体CXCR4结合后，将激活CXCR4偶联的G蛋白下游信号分子. 本研究还发现ERK1/2途径阻断后进一步加剧了MSC增殖的抑制，而p38MAPK途径阻断后反而使SDF?1/CXCR4介导的MSC增殖抑制缓解甚至导致MSC表现为增殖加强. 同时检测细胞周期发现SDF?1处理的MSC更多的处于G0/G1期，进一步说明SDF?1具有抑制MSC增殖的作用. 这些与研究报道的SDF?1/CXCR4通过ERK1/2途径促进HSC增殖的作用相反［6］. 提示SDF?1/CXCR4介导的增殖反应与其作用的细胞类型有关.

【】
  　　［1］ Tang J, Xie Q, Pan G, et al. Mesenchymal stem cells participate in angiogenesis and improve heart function in rat model of myocardial ischemia with reperfusion［J］. Eur J Cardiothoracic Surg, 2006, 3(2): 353-361.

　　［2］ 王承艳,苗振川,丰美福,等.基质细胞衍生因子SDF及其受体CXCR4在造血干/祖细胞动员及归巢过程中的作用［J］.实验血液学杂志,2004,12(1): 115-119.

　　［3］ Sordi V, Malosio ML, Marchesi F, et al. Bone marrow mesenchymal stem cells express a restricted set of functionally active chemokine receptors capable of promoting migration to pancreatic islets［J］.Blood, 2005,106(2):419-427.

　　［4］ 王新均，唐俊明，孔 霞，等. hSDF?1/XCR4介导骨髓源间充质干细胞迁移的信号转导［J］. 第四军医大学学报, 2007, 28(9): 1753-1756.

　　［5］ Ratajczak MZ, Kucia M, Reca R, et al. Stem cell plasticity revisited: CXCR4?positive cells expressing mRNA for early muscle, liver and neural cells “hide out” in the bone marrow ［J］. Leukemia, 2004, 18(1):29-40.

　　［6］ Ganju RK, Brubaker SA, Meyer J, et al. The α?chemokine stromal cell?derived factor?1α, binds to the transmembrane G?protein?coupled CXCR?4 receptor and activates multiple signal transduction pathways ［J］. J Biol Chem, 1998, 273(36):23169-23175.

　　［7］ Petit I, Goichberg P, Spiegel A, et al. Atypical PKC?zeta regulates SDF?1?mediated migration and development of human CD34+ progenitor cells ［J］. J Clin Invest, 2005, 115(1):168-176.

　　［8］ Mathur A, Martin JF. Stem cells and repair of the heart ［J］. Lancet, 2004, 364(9429):183-192.

　　［9］ Vandervelde S, van Luyn MJ, Tio RA, et al. Signaling factors in stem cell?mediated repair of infarcted myocardium［J］.J Mol Cell Cardiol, 2005, 39(2): 363-376.

　　［10］ Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement ［J］. Cytotherapy, 2006, 8(4):315-317.

　　［11］ Kortesidis A, Zannettino A, Isenmann S,et al. Stromal?derived factor?1 promotes the growth, survival, and development of human bone marrow stromal stem cells［J］. Blood,2005, 105(10): 3793-3801.