人EPO基因真核表达载体的构建及其在人脐血间充质干细胞中的表达

           作者：夏桂枝，张国成，陈新民，洪新如

【摘要】  　　目的： 构建人EPO基因真核表达载体并转染人脐血间充质干细胞，获得稳定表达人EPO的人脐血间充质干细胞. 方法： 从人胎肝细胞中提取总RNA，经过RTPCR方法扩增人EPO全长cDNA，应用基因重组技术将EPO cDNA基因亚克隆至pcDNA3真核表达载体内，以酶切和测序方法鉴定重组质粒pcDNA3-EPO构建的正确性，再将pcDNA3-EPO经脂质体介导转染人脐血间充质干细胞，经G418筛选后获得稳定转染EPO基因的人脐血间充质干细胞，用RT-PCR，Western Blot和细胞免疫化学方法鉴定外源人EPO基因在人脐血间充质干细胞中的表达. 结果： 酶切和测序结果均证实pcDNA3-EPO构建正确，RT-PCR，Western blot和细胞免疫化学结果显示转染人EPO基因的人脐血间充质干细胞体外能表达EPO. 结论： 构建成功人EPO基因真核表达载体，转染人脐血间充质干细胞后在体外可获得稳定表达.

【关键词】  细胞生成素 胎血 间质干细胞 转染

　　【Abstract】 AIM: To construct the eukaryotic expression vector of human EPO gene and explore its expression in mesenchymal stem cells (MSCs) derived from human umbilical cord blood (UCB). METHODS: The total RNA was extracted from human fetal liver cells. EPO cDNA was obtained by RT-PCR amplication and subcloned into pcDNA3 vector to construct recombinant pcDNA3-EPO plasmid. After identified by restriction enzyme analysis and sequencing,the pcDNA3-EPO was introduced into the human UCB-derived MSCs mediated by lipofectamine and the expression of exogenous EPO was examined by RT-PCR,Western blot and immunocytochemistry. RESULTS: The recombinant pcDNA3-EPO was shown to meet the design by restriction enzyme analysis and sequencing. The results of RT-PCR,Western blot and immunocytochemical analyses indicated that the exogenous EPO successfully expressed in human UCB-derived MSCs. CONCLUSION: The recombinant pcDNA3-EPO with full coding sequence of human EPO cDNA is successfully constructed and human UCB-derived MSCs with stable expression of exogenous EPO are established.

　　【Keywords】 erythropoietin；fetal blood；mesenchymal stem cells; transfection

　　0   引言
   
　　近年研究发现促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）具有神经营养、神经保护和促进神经发育的作用，在脑组织损伤尤其是新生儿缺氧缺血性脑损伤中发挥着重要作用［1］. 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是近年发现的一种具有多向分化潜能的成体干细胞［2］，而且是外源基因良好的细胞载体［3-4］. 我们构建人EPO基因真核表达载体，将其转染人脐血MSCs，观察EPO在人脐血MSCs中的表达情况，以探索EPO基因修饰的人脐血MSCs用于移植新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）的可行性.

　　1   材料和方法

　　1.1   材料   人胎肝细胞系L02，质粒pcDNA3由福州总实验科王水良博士惠赠. 菌种E. coli DH5α为福州总医院实验科保存. RT-PCR反转录试剂盒（Promega公司）；DNA胶回收试剂盒（上海华尧核酸技术有限公司）；质粒抽提纯化试剂盒（Qiagen公司）；EcoRⅠ，XhoⅠ限制性内切酶，dNTP，Taq酶，T4 DNA连接酶，DNA分子质量Marker DL2000，DL15000（TaKaRa公司）；LipofectamineTM 2000，Trizol（Invitrogen公司）；MSCs培养基MesencultTM（Stem cell公司）；兔抗人EPO抗体、HRP-羊抗兔IgG，Western Blot化学发光试剂（Santa cruz公司）；PVDF膜（Pierce公司）；EliVisionTM Plus试剂盒（北京中杉生物技术公司）.

　　1.2 方法

　　1.2.1   EPO cDNA的合成   参照Trizol说明书抽提人胎肝L02细胞总RNA，反转录为人胎肝细胞总cDNA，以反转录产物为模板，PCR法扩增EPO cDNA. PCR引物根据Genbank中登录的EPO cDNA 全长序列设计两对引物. 扩增EPO cDNA全长序列上游引物： 5′-atgaattcatgggggtgcacgaatgtcc-3′，下划线部分为EcoRⅠ酶切位点，下游引物：5′-gcctcgagtcatctgtcccctgtcctgc-3′，下划线部分为XhoⅠ酶切位点；预期扩增片段长582 bp. RT-PCR法鉴定EPO在人脐血MSCs中表达的上游引物为：5′-tcatctgtgacagccgagtc-3′，下游引物为：5′-cactgacggctttatccaca-3′，预期扩增片段长288 bp. 均由上海生工生物工程公司合成. PCR反应体系如下：总体积为50 μL，10×PCR缓冲液5 μL，dNTP混合液4 μL，待扩增的模板（人胎肝细胞总cDNA）6 μL，上游引物（20 μmol/L）0.5 μL，下游引物（20 μmol/L）0.5 μL，DNA聚合酶1 μL，dd H2O 33 μL. 94℃预变性5 min，94℃ 45 s，59℃ 45 s，72℃ 45 s，共35个循环. 72℃延伸5 min. 取反应产物3 μL，15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定.

　　1.2.2   pcDNA3-EPO表达载体的构建   将PCR法扩增的EPO cDNA和质粒pcDNA3经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段. T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，在氨苄青霉素选择性培养基上筛选阳性克隆. 快速抽提质粒后进行酶切鉴定，将酶切鉴定正确的菌株送上海生工生物工程公司测序. pcDNA3-EPO重组质粒的纯化按质粒抽提纯化试剂盒说明进行.

　　1.2.3   人脐血MSCs的分离培养   脐血标本来自于健康足月顺产新生儿，产妇产前检查均正常，脐血的收集均已征得产妇同意. 无菌条件下采集脐带血，每份30～80 mL，脐血采集后4 h内应用密度梯度离心法分离脐血单个核细胞. 所得单个核细胞以1×109/L接种于MesencultTM完全培养基，置于37℃，50 mL/L CO2和饱和湿度的CO2培养箱中培养.5～7 d后首次换液，7～14 d后贴壁的人脐血MSCs细胞克隆出现，当细胞融合达80%左右时按1∶3的比例传代.

　　1.2.4   pcDNA3-EPO重组质粒稳定转染人脐血MSCs   选择P3代人脐血MSCs，采用脂质体介导转染方法转染EPO基因，按照LipofectamineTM 2000试剂说明书进行. 转染24 h后按1∶10接种到6孔板中，加入新鲜的完全培养基. 次日换液，加入含400 mg/L的G418的筛选培养基培养6 d，再换用含200 mg/L G418培养基培养，2 wk后阳性克隆形成，挑取单个克隆扩大培养和传代.

　　1.2.5   RT-PCR鉴定   抽提稳定转染pcDNA3-EPO的人脐血MSCs总RNA，经无RNA酶的DNA酶处理并抽提纯化后反转录为总cDNA，以总cDNA为模板，采用EPO鉴定引物，PCR扩增EPO cDNA基因片段. PCR反应体系同上方法.

　　1.2.6   Western Blot 鉴定   取生长良好的稳定转染pcDNA3-EPO的人脐血MSCs 1×107，加入RIPA缓冲液（含10 g/L PMSF），冰浴后4 ℃离心取上清，用同样方法从培养的胎肝细胞系L02中抽提蛋白质. 测定蛋白浓度后进行100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳. 电泳完毕后将蛋白转移至PVDF膜上，封闭液封闭，加入兔抗人EPO多克隆抗体（1∶200）结合，洗膜后加入HRP-羊抗兔IgG（1∶5000）结合，再次洗膜后加入Western Blot化学发光试剂，放置1 min后于暗室内用X光片进行化学发光自显影，洗片后采用图像分析仪扫描.

　　1.2.7   细胞免疫化学鉴定   将稳定转染pcDNA3-EPO的人脐血MSCs按5×105/L接种于放置有消毒盖玻片的六孔板内，制备细胞爬片. 24 h后弃掉培养基，细胞爬片用PBS洗2次，加入40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS洗2次. 采用兔抗人EPO多克隆抗体（1∶100），参照EliVisionTM Plus试剂盒说明进行细胞免疫化学染色. 实验对照组用未转染pcDNA3-EPO重组质粒的人脐血MSCs爬片直接进行细胞免疫化学染色.

　　2   结果

　　2.1   pcDNA3-EPO真核表达载体的构建   用PCR法扩增EPO cDNA，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，出现一条特异性区带，位于分子质量标准500 bp附近，与预期大小相符（图1）. 将PCR产物克隆至真核表达载体pcDNA3中，重组质粒pcDNA3-EPO经酶切鉴定后，结果证实所插入基因的位置、大小和方向均正确（图2）；测序结果也表明所构建的质粒符合预期设计.

　　2.2   外源EPO基因在人脐血MSCs中的表达   在288 bp处扩增得到特异性目的片段（图3），表明在转染的人脐血MSCs中有特异性的EPO基因的表达. Western Blot 鉴定结果显示，在转染了pcDNA3-EPO质粒的人脐血MSCs中可检测到EPO蛋白的表达（图4），其蛋白条带位置（34 ku）与阳性对照即人胎肝细胞L02一致，而未经转染的人脐血MSCs无EPO蛋白的表达.

　　1: EPO cDNA ; 2: DNA marker (DL2000).

　　图1   EPO cDNA 的PCR扩增产物（略）

　　1：pcDNA3-EPO的EcoRⅠ/XhoⅠ酶切； 2：pcDNA3-EPO的EcoRⅠ酶切； 3：pcDNA3的EcoRⅠ/XhoⅠ酶切； 4：pcDNA3的EcoRⅠ酶切； 5：DNA marker（DL2000）； 6：DNA marker（DL15000）.

　　图2   重组质粒pcDNA3-EPO的EcoRⅠ/XhoⅠ酶切鉴定（略）

　　1：EPO cDNA片段的PCR产物； 2：DNA marker（DL2000）.

　　图3   外源EPO基因在人脐血MSCs表达的RT-PCR鉴定（略）

　　1：人胎肝细胞； 2：转染EPO基因的人脐血MSCs.

　　图4   外源EPO基因在人脐血MSCs表达的Western Blot鉴定（略）

　　2.3   细胞免疫化学鉴定   转染pcDNA3-EPO的人脐血MSCs胞质呈棕褐色，为EPO阳性表达；未转染pcDNA3-EPO的人脐血MSCs不表达EPO，胞质为蓝色（图5）.  

　　A： 转染； B： 未转染.

　　图5   外源EPO基因在人脐血MSCs中表达的细胞免疫化学鉴定   DAB ×200（略）

　　3   讨论
   
　　HIE是新生儿时期的常见病，目前对重度新生儿HIE尚缺乏特异有效的方法［5］. 近年报道从新生儿脐血中亦分离到MSCs，发现MSCs不仅可分化成多种中胚层来源的细胞，在一定的条件下亦能分化为神经细胞［2］，移植至脑内后能明显改善受损神经系统的功能［6］. MSCs不仅能向神经细胞分化，而且易于外源基因转染和表达，将外源的神经营养因子基因体外转染MSCs，再移植入脑内，神经营养因子在脑内稳定表达，可以增强MSCs移植治疗的效果［3-4］.
   
　　EPO是一种新的、作用很强的神经营养因子，不仅可促进神经前体细胞的增殖和分化，减少神经细胞的凋亡；而且能促进血管内皮细胞的成熟和存活，使血管再生，减轻局部缺氧造成的损害［1］. 脑内的EPO和EPO受体的表达受低氧诱导因子的调控，在缺氧缺血条件下，EPO尤其是EPO受体表达明显增加［7］，因此外源的EPO具有很好的治疗缺氧缺血性脑损伤的作用. 然而EPO仅有极少量透过血脑屏障，并且半衰期短，只有大剂量、多次静脉注射才能取到一定的治疗效果［8］，但大剂量静脉注射易出现红细胞增多，多次注射有导致纯红再障的风险［9］，而脑内注射尤其是多次脑内注射在临床上是行不通的. 将EPO基因通过移植细胞导入脑内，使其在脑内持续表达，就可以发挥EPO的神经营养和神经保护作用，此即为EPO的基因治疗. 而且脑内的EPO不进入血循环，不会出现红细胞增多和纯红再障等不良反应.
   
　　我们选择人EPO基因和人脐血MSCs作为靶基因和靶细胞，将人EPO基因转染人脐血MSCs，获得稳定转染人EPO基因的人脐血MSCs，以期作为一种基因修饰干细胞用于移植治疗重度新生儿HIE，起到EPO基因治疗和MSCs细胞治疗相结合的双重作用. 本实验成功构建出了EPO基因真核表达载体，转染人脐血MSCs后经稳定筛选获得了能稳定表达EPO的人脐血MSCs，为EPO基因修饰的人脐血MSCs用于移植治疗重度新生儿HIE奠定了实验基础. 同时因为EPO是一种具有促红细胞生成作用的造血因子，人脐血MSCs尚具有支持造血的功能［10］，因此EPO基因修饰的人脐血MSCs还可用于临床上各种贫血的治疗，对于探索治疗贫血的新方法也具有重要的实用价值.

【】
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