解偶联蛋白2启动子区-866G/A多态性与中国北方人2型糖尿病的关系

                作者：李建宁，何岚，叶枫，董春萍，王毅

【摘要】  目的： 研究解偶联蛋白2（UCP2）基因启动子区-866G/A的多态性在北方汉族正常人群及糖尿病人群的分布，了解其与2型糖尿病（T2DM）及β细胞功能关系. 方法： 采用PCR及PCR?RFLP 方法检测101名正常人及192名T2DM患者的UCP2基因启动子区-866G/A的多态性，对T2DM患者进行葡萄糖耐量试验，β细胞功能指数及胰岛素敏感指数. 结果： ① -866G/A基因型频率在中国北方汉族正常人群及T2DM人群中的分布分别为：GG31例(30.7%),GA46例(45.5%),AA24例(23.8%)及GG44例(28.1%),GA103例(49.6%),AA45例(22.3%)，统计分析无显著性差异. ② -866G/A多态性的含A等位基因型与胰腺β细胞的胰岛素分泌功能指数ΔI30/ΔG30，HOMAβ，MBCI及INS30呈负相关. 与胰岛素敏感指数IAI无关. 结论： ① 中国北方汉族人群的UCP2基因启动子区-866G/A基因型分布与日本人相似，与欧洲白人及高加索人群存在显著性差异. ② UCP2基因启动子区-866G/A基因型在两组人群的分布无差异. ③ UCP2基因启动子区-866G/A多态性与胰腺β细胞的胰岛素分泌功能相密切相关.

【关键词】  解偶联蛋白2；2型糖尿病；基因多态性

    0引言

    β细胞功能减低和胰岛素抵抗是2型糖尿病（T2DM）发病的主要因子，其发生不仅受复杂的环境因素影响，而且受遗传因素影响，被认为是一类多基因遗传性疾病. 近年的研究显示解偶联蛋白2（UCP2）参与了能量代谢ATP的解偶联，其启动子区-866G/A多态性影响了胰腺β细胞功能，为糖尿病发生危险性的预测因子. 我们对中国北方汉族人群中UCP2 基因启动子区-866G/A多态性与T2DM及胰腺β细胞分泌功能的相关性进行研究.

    1对象和方法

    1.1对象糖尿病组（DM）：192名T2DM患者来自2005?03/2005?12西安大学第一附属内分泌科门诊及病房，诊断标准1999年世界卫生组织（WHO）的糖尿病诊断标准：空腹血浆葡萄糖水平（FPG）≥7.0 mmol/L和/或75 g葡萄糖耐量试验（OGTT试验）服糖后2 h血浆葡萄糖水平（PG2h）≥11.1 mmol/L. 所有患者年龄≥35岁，有严重心、脑、肝、肾功能损害及影响糖代谢的其他内分泌疾病者被排除在外. 非糖尿病组（NDM）：101名非糖尿病患者来自西安交通大学第一附属医院体检中心，年龄≥35岁，FPG<6.1 mmol/L并且PG2h<7.8 mmol/L，除外严重心、脑、肝、肾功能损害及糖尿病家族史者.

    1.2方法

    1.2.1一般观察指标记录两组患者的姓名、性别、年龄、发病年龄、病程、收缩压（SP）,舒张压（DP），并测定空腹总胆固醇（CHOL）,三酰甘油（TG）,高密度脂蛋白（HDL）及低密度脂蛋白（LDL）,并计算体质量指数（BMI）.

    1.2.2OGTT试验T2DM患者于夜间禁食8～10 h，于第2日清晨空腹服用75g葡萄糖，分别于0，30，60，120，180   min取静脉血，测定空腹血糖(FPG), 30 min血糖（PG30）, 60 min血糖(PG1h), 120 min血糖（PG2h）, 180 min血糖（PG3h）及空腹胰岛素(FINS), 30 min胰岛素（INS30）, 60 min胰岛素（INS1h）, 120 min胰岛素（INS2h）, 180 min胰岛素（INS3h）.

    1.2.3胰岛素敏感性及分泌功能指标［1-3］胰岛素分泌指数(Homa?β)= 20×FINS/(FPG?3.5)，胰岛素分泌指数(ΔINS30/ΔPG30)=(INS30?FINS)/(PG30?FPG)，新β细胞功能指数（MBCI）=(FPG×FINS)/(PG2h+PG1h?7.0)，空腹血糖胰岛素乘积的倒数（IAI=1/(FPG×FINS).

    1.2.4UCP2基因启动子区-866G/A多态性的PCR?RLFP分析采用离心柱型血液基因组DNA提取试剂盒（北京天为时代科技有限公司）提取人基因组. 上游引物：5′?CACGCTGCTTCTGCCAGGAC?3′，下游引物：5′?AGGCGTCAGGAGATGGACCG?3′（ 北京奥科生物技术有限责任公司），PCR反应条件［4］：首先在95℃变性8 min，然后95℃变性1 min，65℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸7 min. 使用2×Taq Plus PCR MasterMix（北京天为时代科技有限公司）进行PCR. 取PCR产物10 μL加入10 U的Mlu1限制性内切酶37℃水浴过夜，消化片段用25 g/L琼脂糖电泳分离，EB显色，在紫外灯下观察并记录结果. G等位基因者被Mlu1切为两段（291 bp和70 bp）,而A等位基因则不被切开（361 bp，图1）.

    统计学处理：  以Hardy?Weinberg 平衡检验确认研究样本的群体代表性,分类变量比较使用χ2检验，连续变量以x±s表示，与基因型的关系使用方差分析（one?way ANOVA）检验，使用Logistic Regression 进行连续变量与基因型的多因素分析（对性别、年龄、病程、发病年龄进行校正）.  P<0.05认为有显著性差异，所有数据使用SPSS 11.5统计软件进行分析.

    图1UCP2 -866G/A基因多态性的 PCR?RLFP结果

    2结果

    2.1一般资料的Hardy?Weinberg 平衡检验两组的Hardy?Weinberg平衡检验P值均>0.05，表明两组的研究样本的群体代表性好. 两组在性别方面存在差异，因性别不影响基因型的表达，故对试验无影响. DM组的BMI，FPG，CHOL及TG比NDM组高，有统计学意义，而年龄、血压及HDL无差别（表1）. 表1糖尿病组与非糖尿病组的一般临床资料比较

    2.2UCP2启动子区-866G/A基因型频率在不同种族人群中的比较-866G/A的基因型频率在各种族间有明显差异. 两两比较显示中日之间无差异（P=0.480，表2），高加索人与欧洲白人之间无差异（P=0.345），中国人与高加索人、欧洲白人之间有显著性差异（P=0.000）. 表2不同种族UCP2启动子区-866G/A基因型频率的比较

    2.3DM组与NDM组UCP2启动子区-866G/A基因型频率的比较-866G/A基因型在DM人群与NDM人群的分布无差异（表3）. 表3DM组与NDM组-866G/A基因型频率的比较

    2.4DM组UCP2启动子区-866G/A的不同基因型一般资料比较-866G/A的三种基因型在年龄、BMI、发病年龄、病程、血脂方面无差异（表4）.表4DM组-866G/A的不同基因型一般资料比较

    2.5DM组UCP2启动子区-866G/A不同基因型胰岛素敏感性及胰岛β细胞功能比较-866G/A的三种基因型在PG2h，INS30有显著性差异，AA型较GG型有更高的PG2h，更低的INS30，并且胰岛β细胞分泌胰岛素功能指标ΔI30/ΔG30，HOMAβ，MBCI明显减低. 胰岛素敏感性指标IAI无差异（表5）. 多重比较显示：PG2h，INS30，ΔI30/ΔG30，HOMAβ，MBCI等指标在GG型与GA，AA型之间有显著性差异，而在GA型与AA型之间无差异（表6）.

    2.6Logistic Regression分析由于单因素分析GA型与AA型无显著性差异，将GA型与AA型合并为含A基因型，采用Logistic Regression 校正年龄、BMI、发病年龄、病程以后，GG型与含A基因型（GA+AA）在PG2h，INS30，ΔI30/ΔG30，HOMAβ，MBCI这些指标上仍存在显著性差异. 表5DM组-866G/A的不同基因型胰岛素敏感性及胰岛β细胞功能的比较表6DM组三种基因型胰岛β细胞功能的多重比较

    3讨论

    UCP 作为线粒体内膜的质子载体，能将线粒体内膜外侧的H+运回内膜内侧，降低膜两侧的电化学梯度，使氧化过程与ADP磷酸化过程解偶联，ATP 生成减少,而以产热的形式释放能量，在能量的代谢中具有重要的作用.

    　　UCP2组织分布广泛，其在脂肪组织中的过低表达，将会引起肥胖. Krempler F等［7］报告UCP2-866G/G型等位基因者的UCP2基因在脂肪组织中呈现低表达，是中年高加索人肥胖的危险因素. 而Sasahara M等［5］在日本人群的实验未发现UCP2 -866G/A多态性与肥胖的关系，但是其GG型明显少于高加索人，AA型明显多于高加索人. 我们的实验结果与日本人的相似，由于汉族人与日本人的BMI相似，与欧洲人差异明显，推测肥胖除与环境因素有关外，UCP2基因可能在其中发挥了一定的作用.

    　　Krempler等［7］发现，GG型糖尿病患病率明显减少. D?Adamo等［6］发现，AA型的女性患者的糖尿病患病率明显增加，在男性中无统计学差异. 而在日本人群中未发现糖尿病患病率的改变. 我们的实验结果与日本人研究相似，与欧洲人不一样. 这种差异可能与样本的选择有关（因人与日本人的体质量指数比欧洲人明显减少），也可能与遗传背景的差异有关.

    　　UCP2存在于胰腺β细胞中，可通过影响ATP合成而影响β细胞的胰岛素分泌功能. Chan 等［8］发现在细胞培养时，UCP2 mRNA的高表达导致β细胞胰岛素分泌减少. Zhang 等［9］发现UCP2 基因剔除小鼠患有高胰岛素血症. 将-866G和-866A转染进入PAZ脂肪细胞及胰腺β细胞，-866A展现出较高的转录活性，UCP2的表达量明显增高［5,7,10］，提示A等位基因可能通过增加UCP2的表达量减少胰腺β细胞ATP合成而影响胰岛素的分泌功能. 我们的实验发现，GG型与GA型、AA型相比较ΔI30/ΔG30, HOMAβ, MBCI及INS30明显增高，而FINS, INS2h, INS3h及胰岛素敏感指数IAI则无差别. 而G/A型与A/A型相比较则无上述的差异，表明含A基因型的个体的β细胞功能受损. 由于G/A型与A/A型相比较无显著性差异，因此将其合并为含A基因型，与GG型进行Logistic回归分析，显示含A基因型是独立于年龄、BMI、发病年龄及病程的胰岛素分泌功能下降的危险因素. Sasahara等［5］通过静脉注射25g葡萄糖，胰岛素分泌功能△IRI4在含A基因型人群中明显下降，而胰岛素敏感指数SI及SG无差异. Sesti等［10］在IGT人群中发现早期胰岛素分泌功能指数I30/I0 在AA型明显下降，而胰岛素敏感指数无显著性差异. 这些研究结果与本实验结果相似.

    综上所述，我们的研究显示： ① 中国北方汉族人群的UCP2-866G/A基因型分布与日本人相似，与欧洲白人及高加索人群存在显著性差异. ② UCP2－866G/A基因型在DM人群与NDM人群的分布无差异. ③ DM人群中含A基因型的胰岛β细胞分泌功能显著低于GG型，说明含A基因型可能是DM发生的危险预测因子.

    致谢： 本实验得到了楚庸烈教授的精心指导，分子生物学实验部分在西安大学医学院微生物分子生物实验室完成.

【】
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