乳腺癌及癌旁组织中VEGF及survivin?2B mRNA的表达意义

【摘要】  目的： 观察乳腺癌及癌旁组织中VEGF及survivin?2B mRNA表达情况，并探讨其与临床病指标的关系. 方法： 以逆转录?聚合酶链反应（RT?PCR）法检测60例乳腺癌及癌旁5 cm正常乳腺组织标本VEGF及凋亡抑制因子survivin剪接体survivin?2B mRNA表达，半定量分析电泳结果. 结果： 在60例乳腺癌标本中VEGF及survivin剪接体survivin ?2B mRNA均高表达，与癌旁正常乳腺组织中差异有统计学意义（P<0.01）, VEGF mRNA及survivin?2B在乳腺癌组织中的高表达呈正相关（r=0.576, P<0.05），同时VEGF及survivin?2B mRNA的表达与淋巴结转移有关（r=0.482，P<0.05）. 结论： VEGF及survivin?2B因子为乳腺癌发生、过程中的重要因子，可对患者的及预后作预测.

【关键词】  乳腺肿瘤 基因 血管内皮生长因子类 Survivin

    0引言

    随着人民生活水平的提高，生活环境的变化及各种影像学检查的完备，乳腺癌检出率逐步提高,近年来其发病率呈明显上升趋势，已列为女性恶性肿瘤的首位. 如何尽早发现乳腺病变成为目前重要的研究课题. 肿瘤的发生和发展是一个多基因和环境因素参与的过程，研究证实肿瘤的生长有赖于血管向其提供充足的营养，为其细胞增殖、侵袭和转移提供必要的物资条件. survivin?2B是近年来发现的Survivin［抗凋亡因子，凋亡抑制家族（IAP）中的新成员］的剪接体，是survivin中最具特异性因子［1］. 我们采用RT?PCR检测乳腺癌及癌旁正常乳腺组织中VEGF及survivin?2B的扩增情况，与临床病理学指标对比分析，以探讨VEGF及survivin?2B与乳腺癌浸润和转移的关系.

    1材料和方法

    1.1材料我院2002?05/2008?03乳腺癌患者切除的癌组织及距肿瘤5 cm的癌旁非癌乳腺组织标本，能进行随访并经病理证实为乳腺癌的石蜡包埋组标本60例，均为女性，术前均未行化疗、放疗和内分泌治疗. 患者年龄25～68（平均48）岁. Ⅰ期11例，Ⅱ期39例，Ⅲ期10例. 原位癌38例，有腋窝淋巴结转移的22例. 行乳腺癌根治术12例，改良根治术48例. Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司），M?MLV逆转录酶，RNAsin和Gotaq Green Master Mix均购自美国Promega公司. 引物由上海生工公司合成. 梯度PCR仪及凝胶成像系统Quantity One Version 4.6.3（美国Bio?Rad公司）.

    1.2方法VEGF上游引物5′?GGAGCTTCAGGACATTGCTGTG?3′，下游引物为5′?GGAGGAAGGTCAACCACTCAC?3′, 扩增片段353 bp, 由于survivin共有5条条带，故设计引物控制能出现的条带为survivin及其剪接体survivin?△Ex3,survivin?2B 3条条带，共有上游引物为5′?GAGAACGAGCCAGACTTGGC?3，下游引物为 5′?CCTCTGGTGCCACTTTCAAGA?3′，扩增片段461 bp，344 bp，530 bp. GAPDH上游引物为5′?AGTCCACTGGCGTCTTCAC?3′，下游引物为5′?GCTTGACAAAGTGGTCGTTGAG?3′;扩增片段639 bp. 用Trizol试剂提取乳腺癌、癌旁组织总RNA. RNA纯度A260/A280均在1.8～2.0之间. RT反应体系：模板RNA 2 μg， Oligo?dT18 0.5 μg，70℃变性5 min,冰上冷却5 min，加入5×RT缓冲液5 μL, dNTPs 1.25 μL(each 10 mmol/L), RNasin 416.75 nkat, M?MLV 3334 nkat，1 mL/L DEPC水补至反应终体积25 μL，42℃反应60 min，72℃反应15 min，合成的cDNA置-20℃保存. PCR反应体系：在反应体系25 μL中Gotaq Green Master Mix 12.5 μL，上下游引物各0.8 μmol/L，cDNA 1.5 μL，Nuclease?Free Water 7.0 μL，入PCR仪. 反应条件：95℃预变性2 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环，72℃延伸 5 min. 取10 μL PCR产物在含有溴化已锭的10 g/L琼脂糖凝胶上电泳，5 V/cm，在凝胶成像系统下成像分析. 将GAPDH条带的吸光度值定为10，取目的基因条带与GAPDH条带吸光度值的比值作为目的基因的相对值.

    统计学处理：采用秩和检验方法，用SPSS11.5统计软件进行统计学分析.

    2结果

    2.1乳腺癌组织与癌旁5 cm正常乳腺组织中VEGF，survivin?2B转录情况由于survivin?2B及survivin?△Ex3均为Survivin的剪接体，故出现三条带（图1）. VEGF及survivin?2B mRNA在乳腺癌组织中均有较高表达，在癌旁5 cm正常乳腺组织中均低表达，差异有统计学意义（P<0.05，表1）.

    1: marker; 2~11: VEGF在癌旁组织的表达; 12~16: VEGF在癌组织的表达. GAPDH: 癌组织物.

    图1乳腺癌组织中VEGF及survivin?2B的表达

    表1乳腺癌与癌旁组织中VEGF及survivin?2B mRNA的表达指标〖〗组织〖〗平均秩序〖〗表达数〖〗Z*〖〗PVEGF〖〗乳腺癌〖〗47.53〖〗45〖〗-2.001〖〗0.031〖〗癌旁〖〗58.42survivin?2B〖〗乳腺癌〖〗45.62〖〗34〖〗-2.345〖〗0.040〖〗癌旁〖〗57.68*：数据非正态分布，采用秩和检验.

    2.2乳腺癌组织中Survivin及其剪接体survivin?△Ex3,survivin?2B转录与临床病指标的关系淋巴结转移与VEGF及survivin?2B的表达相关(P<0.05)；临床病理学分期、肿块大小与标本中VEGF表达相关，临床病理学分期、年龄、肿块大小与标本中survivin?2B mRNA表达无关（表2）.表2VEGF及survivin?2B mRNA在癌组织中表达与临床病理学指标的关系临床病理

    3讨论

    VEGF又称血管内皮细胞生长因子，特异性地作用于血管内皮，促进血管内皮细胞增殖，并在体内诱导血管形成. 我们发现，VEGF在乳腺癌组织中的阳性表达明显高于癌旁组织(P<0.05)，乳腺癌组织中VEGF阳性表达率为75％. 同时VEGF的表达与肿瘤直径大小存在相关性，这与［2］存在不同，分析原因在于其采用的为免疫组化的方式，在计数上和观察上与RT?PCR的方式存在不同. 而存在淋巴结转移者VEGF的表达率明显高于无淋巴结转移者(P<0.05). 随着临床分期的升高VEGF的阳性率逐渐上升(P<0.05). 这些表明VEGF在乳腺癌的进展过程中起重要作用，与肿瘤的浸润转移密切相关.

    生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白(inhititor of apoptosis protein, IAP)家族的一个新成员，主要分布在胚胎及分化未成熟的组织，高表达于多种恶性肿瘤组织，而在终末分化的正常成熟组织中不表达［3］. 这些功能和分布特点提示生存素与肿瘤的发生、密切相关. 人的生存素基因有4个明显的（1,2,3和4）和2个隐藏的（2B和3B）外显子［4］. 生存素前提RNA的选择性剪接生成了4个不同的剪接变体，导致相应的蛋白质结构发生显著变化［5-6］. survivin?2B为survivin的一个剪接变体，其保留部分内含子2作为隐蔽的外显子，导致相应的蛋白质结构发生显著的变化，因此无抗凋亡功能甚至有负调控功能［7］；本研究中survivin?2B在乳腺癌组织中的阳性表达明显高于癌旁组织(P<0.05)；survivin?2B与乳腺癌患者年龄及肿块大小无特异的相关性；survivin?2B与淋巴结转移相关(P<0.05). 本研究同时显示，survivin?2B表达与乳腺癌患者的临床病理学分期无关.

    总之，VEGF及Survivin剪接体survivin?2B因子是乳腺癌发生、发展过程中的重要因子，与其他预后指标联合检测可望对患者的以及预后作出更准确的预测.

【文献】
  ［1］ Ryan B, O Donovan N, Browne B, et al. Expression of survivin and its splice variants survivin?2B and survivin?Delta Ex3 in breast cancer［J］. Br J Cancer,2005, 92(1):120-124.

［2］ 秦双,来俊英. COX?2，VEGF在乳腺癌组织中的表达及临床意义［J］. 医学信息. 手术学分册,2007,(8):675-677.

［3］ Altierii DC. Validating survivin as a cancer therapeutic target［J］. Nat rev Cancer, 2003,3:46-54.

［4］ Badran A, Yoshida A, Ishikawa K, et al. Identification of a novel splice variant of the human antiapoptosis gene surviving［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2004,314:902-907.

［5］ Gradilone A, Gazzaniga P, Ribuffo D, et al. Survivin, bcl?2, bax and bcl?x gene expression in sentinel lymph nodes from melanoma patients［J］. J Clin Oncol, 2005, 21:306-312.

［6］ Kennedy SM, Odriscoll L, Purcell R, et al. Prognostic importance of survivin in breast cancer［J］. Br J Cancer, 2003,88:1077-1083.

［7］ O?Driscoll L, Linehan R, Clynes M. Survivin：Role in normal cells and in pathological conditions［J］. Curr Cancer Drug Targets，2003,3(2):131-152.