大黄素对肝细胞模拟冷缺血再灌注损伤的保护作用及机制

【摘要】  目的: 观察中药大黄素对肝细胞模拟冷缺血再灌注损伤是否具有保护作用，探讨其可能的保护机制. 方法: 体外培养肝细胞株HL?7702，随机分为对照组和大黄素处理组. 对照组未予大黄素处理，大黄素处理组分为100，10，1 μmol/L 3个浓度组，建造模拟冷缺血再灌注模型，分别检测各组上清液中乳酸脱氢酶（LDH），细胞内超氧化物岐化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平；流式细胞技术检测细胞内活性氧（ROS）水平. 结果: 冷缺血8 h再灌注6 h后，中、高浓度大黄素处理组LDH分别为（198.83±14.22） U/L，（179.67±18.57） U/L，显著低于对照组的（351.33±34.16） U/L（P<0.01）；MDA分别为（7.80±0.88）μmol/L，（4.97±0.71）μmol/L，显著低于对照组的（16.67±1.14）μmol/L（P<0.01）；SOD分别为（14.32±1.53）×103 U/L，（18.64±1.38）×103 U/L，显著高于对照组的（8.56±0.94）×103 U/L（P<0.01）. 高、中、低浓度大黄素处理组ROS阳性细胞率分别为0.1140±0.0037，0.1599±0.0039，0.9527±0.0080，均低于对照组的0.9974±0.0006（P<0.01）；各浓度大黄素处理组之间差异具有统计学意义（P<0.05）. 结论: 大黄素对肝细胞模拟冷缺血再灌注损伤具有保护作用，其保护机制可能与清除氧自由基，降低细胞内活性氧水平有关. 
【关键词】  大黄素 肝细胞 再灌注损伤
　　1材料和方法
　　1.1材料肝细胞株HL?7702（院上海生命科学研究院细胞库）； RPMI(Roswell Park Memorial Institute)1640培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程研究所）；混合气体950 mL/L N2－40 mL/L CO2－10 mL/L O2（西安大学医学院后勤中心）；大黄素，2,7?二氯荧光素二脂(2?,7??dichlorofluorescin? diacetate, DCFH?DA)荧光探针（美国Sigma公司）；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH），超氧化物岐化酶（super oxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；流式细胞仪（FACSCabuliburTM, 美国贝克曼库尔特有限公司）；Olympus倒置显微镜（IX70?81FZ，日本Olympus公司）.
　　1.2方法
　　1.2.1冷缺血再灌注损伤模型的建立及实验分组模拟冷缺血再灌注模型参照［4］的方法并加以改进：①肝细胞HL?7702体外培养至对数生长期，等量均匀接种于6孔板或25 mL培养瓶中，给予大黄素干预，按100，10，1 μmol/L分为高、中、低浓度组和对照组（未予大黄素干预），培养24 h准备实验. ②模拟缺血：将培养液吸弃，等体积加入模拟缺血溶液（NaCl 98.5 mmol/L，KCl 10 mmol/L，NaH2PO4 0.9 mmol/L，NaHCO3 6.0 mmol/L，CaCl2 1.8 mmol/L，MgSO4 1.2 mmol/L，乳酸钠 40 mmol/L，HEPES 20 mmol/L，pH 6.8，4℃）. 再将培养容器放入缺氧培养装置中，充入混合气体(950 mL/L N2－40 mL/L CO2－10 mL/L O2)，待氧分压≤1%时，同时关闭进气口与出气口，放入4℃冰箱保存8 h. ③模拟再灌注：取出培养容器，吸弃模拟缺血溶液，等体积加入模拟再灌注液（NaCl 129.5 mmol/L，KCl 5.0 mmol/L，NaH2 PO4 0.9mmol/L，NaHCO3 20 mmol/L，CaCl2 1.8 mmol/L，MgSO4 1.2 mmol/L，葡萄糖 55 mmol/L，HEPES 20 mmol/L，pH 7.4，37℃），放入50 mL/L CO2孵箱中37℃培养6 h.
　　1.2.2细胞形态学、LDH,SOD,MDA及细胞内活性氧水平检测倒置显微镜观察单纯冷缺血与再灌注后细胞形态学变化. 上清液LDH含量及细胞内SOD,MDA水平严格按照试剂盒说明书操作检测. DCFH?DA荧光探针负载细胞检测细胞内ROS水平，终浓度10 μmol/L ，37℃避光孵育30 min，PBS洗涤3遍，消化至悬，流式细胞仪分析结果，阳性细胞百分率和平均荧光强度代表ROS水平. 
　　统计学处理：数据结果用 表示. 采用 SPSS 13.0 进行统计分析. 统计方法采用单因素方差分析，多重比较用LSD?t检验. P<0.05为差异具有统计学意义.
　　2结果
　　2.1倒置显微镜下细胞形态学改变再灌注后6 h细胞形态较单纯冷缺血8 h时损伤加重，倒置显微镜下可见细胞变圆、轮廓模糊、形态不规则、皱缩、漂浮细胞增多（图1）.    
   
　　A：单纯冷缺血8 h后；B：冷缺血8 h再灌注6 h后.
　　图1冷缺血再灌注后细胞形态学改变RM ×100（略）
　　2.2上清液LDH，细胞内MDA水平及SOD活性变化上清液中LDH及细胞内MDA含量高、中浓度大黄素处理组均低于对照组，而细胞内SOD活性高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.01）；随着大黄素浓度的增加，LDH，MDA水平逐渐降低，SOD活性逐渐增高，各浓度大黄素处理组之间差异具有统计学意义（P<0.01，表1）.
　　表1上清液LDH、细胞内MDA, SOD及ROS水平检测结果（略）
　　aP<0.05,  bP<0.01 vs 对照. LDH：乳酸脱氢酶； MDA：丙二醛； SOD：超氧化物歧化酶； ROS： 活性氧.
　　2.3细胞内ROS水平变化流式细胞技术分析结果显示，ROS水平大黄素处理组较对照组显著降低，差异具有统计学意义（P<0.01）；随大黄素浓度增加，ROS水平有降低的趋势，各浓度大黄素处理组之间差异具有统计学意义（P<0.05，表1）；从100，10，1 μmol/L浓度组到对照组，可见流式图峰值逐渐右移，细胞内活性氧水平逐渐增高（图2）. 
  
　　A：100 μmol/L大黄素组； B：10 μmol/L大黄素组； C：1 μmol/L大黄素组； D：对照组.
　　图2模拟缺血再灌注后肝细胞内活性氧水平（略）
　　3讨论
　　临床肝移植过程中，不可避免的存在肝脏冷缺血再灌注损伤. 我们所用的体外模拟冷缺血再灌注模型，采用低钠、高钾、代酸、缺糖、无血清溶液模拟缺血时肝细胞微环境，并充入混合气体模拟缺氧过程，4℃冷保存模拟冷缺血过程；冷缺血8 h后用正常电解质、正常pH值、富糖、富血清溶液模拟再灌注时肝细胞微环境，并复温复氧模拟再灌注过程. 此模型充分考虑了冷缺血再灌注过程中温度、供氧、营养、电解质、酸碱度的变化，相对全面的模拟了该病理生理过程. 本实验中观察到再灌注后细胞形态较单纯冷缺血时损伤加重，倒置显微镜观察结果可推断其发生了冷缺血再灌注损伤.
　　有研究［1,3］认为，大黄素可以增加线粒体抗氧化剂组分，清除氧自由基，保护生物膜免受过氧化损伤. 本实验中，大黄素处理组肝细胞内SOD活性增高，MDA含量减少，作用具有浓度依赖性. 说明大黄素确实能够增加细胞内抗氧剂组分，使细胞膜脂质过氧化损伤减少，与报道的结果一致.
　　过氧化损伤为缺血再灌注损伤重要机制之一［5-7］，我们观察发现再灌注损伤后，随ROS水平升高，细胞培养上清液中LDH含量增高、细胞损伤加重的现象. 而随着大黄素浓度增高，细胞内ROS水平降低，细胞损伤减轻［8］. 说明大黄素可能通过降低细胞内ROS水平、清除氧自由基，减轻肝细胞冷缺血再灌注损伤. Su等［9］认为大黄素可造成肿瘤细胞内ROS升高，诱导肿瘤细胞凋亡. 本实验结果表明大黄素可降低正常细胞内ROS水平，减轻缺血再灌注损伤. 这种双重作用可能与大黄素对一些致癌基因信号转导的特异性靶向作用有关［10］， 但具体机制目前仍不清楚.
　　综上所述，本研究从细胞水平初步探讨了大黄素对肝细胞模拟冷缺血再灌注损伤的保护作用，其作用机制可能与清除氧自由基，降低细胞内活性氧水平有关，为大黄素在临床肝移植中的应用提供了实验依据.
【文献】
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