带有荧光素酶报告基因的可调控重组腺病毒载体的构建及表达

【摘要】  目的: 构建带有萤火虫荧光素酶报告基因的可调控腺病毒载体,并在SW620结肠癌细胞株中观察其调控表达. 方法： 将萤火虫荧光素酶luc基因和启动子，以及RU486调控系统构建成单一的穿梭载体PDC?RULUC，将其与Admax腺病毒包装系统的辅助质粒共转染293细胞后，构建出可调控的重组腺病毒载体. 扩增后用最终稀释法测定了其滴度，并在SW620细胞中检测了其基因调控效果. 结果： 成功地构建了携带有RU486调控系统的可调控腺病毒载体Ad?RULUC，病毒滴度达到5.2×1013pfu/L. 当给予诱导剂RU486后，腺病毒载体可以诱导表达荧光素酶，并在一定范围内两者呈正比，而没有RU486时，几乎没有报告基因的表达. 结论: 腺病毒 Ad?RULUC能调控外源基因的表达，为基因调控研究和基因提供了良好的工具. 
【关键词】  腺病毒载体 基因调控 末非司酮 荧光素酶

　　0引言
 
　　利用腺病毒载体转移外源基因是基因治疗和基因功能研究中常用的方法. 随着腺病毒载体系统研究的深入，尤其是空壳载体的成功应用，外源性基因表达的效率和时间有了明显的提高［1］. 然而，基因的过度表达或不适当的表达不仅影响到对其功能的研究，而且在基因治疗中也可能会对机体产生致命的副作用，因此实现对目的基因的表达时间和表达水平的精确调控是非常重要的，也是目前载体系统的难点之一. 通过诱导调控系统来实现基因的精确表达是最常用的方法，在已构建成的多种诱导调控系统中，RU486诱导调控系统具有诸多优点，是目前功能相对完善的基因调控系统，其应用日益广泛［2］，为此，我们将RU486诱导调控系统与腺病毒载体相结合，成功构建了RU486诱导调控的腺病毒载体，并用荧光素酶报告基因，在体外验证了其对基因表达的调控作用，在国内少见类似报道. 
　　1材料和方法
　　1.1材料SW620结肠癌细胞株购自中科院上海细胞所；腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3cre和HEK293细胞株购自加拿大Microbix Biosystems公司；pDC313穿梭载体；含有启动子和绝缘子的pB?Ins?hCMV质粒均为东方肝胆外科病毒基因治疗实验室保存；萤火虫荧光素酶质粒pGL3?Basic购自 Promega公司；含有GLP65反式作用调控因子和GAL4杂合启动子两个组件的质粒pRS由西班牙Navarra大学医学院钱程教授惠赠. 各种限制性内切酶购自New England Biolab 公司；诱导剂RU486购自SIGMA公司；DNA连接试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；新生小牛血清购自Gibco公司；Luciferase Reporter Assay购自 Promega公司；真核细胞转染试剂lipofectamine2000购自Invetrogen 公司；胎牛血清、小牛血清购于Gibco BRL公司，胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒、病毒DNA提取试剂盒均购于QIAGEN公司. LB?9506型Luminometer(Berthold公司)；PCR仪(德国BIOMETRA公司)；Napc05420二氧化碳孵箱(法国JOAVN公司)；6孔板(丹麦NUNC公司). PCR引物设计采用OLIGO分析软件在机上进行,正义引物和反义引物的5′端均设计有酶切位点,且其外侧设有保护性碱基. 萤火虫荧光素酶（LUC）基因鉴定引物序列如下：正义引物5′?CGCATGCCAGAGATCCTATTT?3′，反义引物5′?CGGGAGCCACCTGATAGC?3′，引物由Invetrogen 公司合成.
　　1.2方法
　　1.2.1穿梭质粒构建与鉴定利用分子生物学技术，将萤火虫荧光素酶luc基因和启动子，以及RU486调控系统构建成单一的质粒载体PDC－RULUC，为减少两个转录单元之间的潜在干扰，加入了1600 bp的绝缘子. 载体构建流程如下：①pB?Ins?luc 用NheI和KpnI切下的Ins?luc片段,插入pRS?17质粒的NheI和KpnI位点,重组质粒命名为pRS?RULUC. ②NotⅠ单酶切下pRS?RULUC中的调控表达框和LUC基因表达框部分装入pDC312载体的NotⅠ位点中，构建成穿梭质粒pDC?RULUC. 通过PCR和限制性内切酶及测序，筛选阳性重组子.
　　1.2.2重组腺病毒的制备与鉴定重组腺病毒载体Ad?RULUC的构建采用 AdMax腺病毒载体包装系统. 将穿梭质粒pDC?RULUC与以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3cre，通过lipofectamine2000试剂共转染至293细胞，通过Cre/loxP重组酶介导下的位点特异性重组，使共转染到293细胞中的穿梭质粒和骨架质粒在重组酶的作用下产生重组腺病毒，得到的重组病毒是E1/E3缺失的复制缺陷型腺病毒. 操作方法如下：在6孔培养板中每孔接种3×105个HEK293细胞，将带目的基因的腺病毒穿梭质粒与腺病毒骨架质粒各2 μg，用lipofectamine2000试剂20 μL共转染HEK293 细胞， 隔2～3 d 换液1 次，约7～10 d细胞出现病变，在显微镜下可见细胞变圆、脱落，这表明质粒在HEK293 细胞中发生了同源重组. 经过3次病毒空斑纯化，即得到携带LUC基因的可调控重组腺病毒. 得到的重组载体用LUC基因的引物行PCR鉴定，以PGL3?luc basic作阳性对照，并设空白阴性对照.
　　1.2.3重组腺病毒载体的扩增纯化及滴度测定（TCID50法）重复感染293细胞，进行少量扩增，待全部细胞出现明显的CPE（48 h后），收集上清及沉淀混合液，于-80℃～37℃反复冻融3次，破碎细胞，离心，取病毒上清再次感染293细胞，进行大量扩增，48 h后收集沉淀，加入Ad Buffer,以CsCl密度梯度超速离心法纯化病毒2次. 病毒滴度的检测以293细胞为靶细胞（1×108/L）,病毒液从1×10-4开始到1×10-11，行10倍连续稀释后分别感染293细胞，每一稀释度设10个复孔，阴性对照孔加含血清20 mL/L的DMEM培养液2 mL，10 d后观察细胞病理反应（CPE），仅有小块或一些细胞出现CPE，该孔计数为阳性. 病毒的稀释度以最低稀释度能感染所有293细胞、最高稀释度完全不能感染293细胞为宜. 根据TCID50法计算公式，算出病毒的滴度.
　　1.2.4重组可调控腺病毒载体的表达用携带萤火虫荧光素酶报告基因可调控重组腺病毒感染结肠癌细胞株SW620，予不同浓度的RU486诱导表达. 操作步骤：将生长状态良好的SW620细胞以2×105个细胞/孔接种于6孔板中，待细胞完全贴壁生长至60％～80％融合时，予重组可调控腺病毒以MOI=100感染细胞后继续培养细胞24 h，分成七个处理组，各组加入一定量的RU486，使培养液的药物浓度分别达到0，1×10-5，1×10-6，1×10-7， 1×10-8，1×10-9，1×10-10mol/L，每组均设复孔. 继续孵育48 h后行荧光索酶检测，而复孔组实验细胞则予更换新的RPMI 1640培养液后继续孵育48 h后检测荧光索酶活性.
　　1.2.5荧光素酶表达的检测采用荧光素酶报告基因检测试剂盒测定报告基因的表达水平. 实验步骤简述如下：弃去6孔细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤细胞2次，向每一孔中加入500 μL的Passive Lysis Buffer(PLB)，在室温轻轻震荡15 min后，收集细胞裂解液. 取20 μL的细胞裂解液至荧光测定管中，加入100 μL萤火虫荧光素酶检测试剂 ，混匀后用Luminometer荧光计量仪测定萤火虫荧光素酶的活性，每一裂解样品经3次检测后取其平均值，计算萤火虫荧光素酶的表达值. 具体操作步骤参见Promega公司的Luciferase Assay System检测试剂盒说明书.
　　统计学处理:  所有数据用x±s表示，SPSS10.0软件包处理实验数据，组间比较用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义.
　　2结果
　　2.1穿梭质粒PDC?RULUC的酶切鉴定构建的穿梭质粒PDC?RULUC予BglⅡ酶切，可得3697，3440，2824，1161 bp 4个片段，其中3697，3440 bp 2个片段重合，KpnⅠ酶切可得7545、3577 bp片段，SpeⅠ酶切，可得11 122 bp片段(图1)，实验结果与设计相符，证明载体构建正确.
 
　　1:Bgl Ⅱ酶切； 2:KpnⅠ酶切； 3：Marker; 4:SpeⅠ酶切.
　　图1重组载体PDC?RULUC 酶切鉴定（略）
　　2.2质粒测序鉴定对重组质粒的主要元件，包括GLP65反式作用调控因子(Regulator)和GAL4杂合启动子(GalE1b)，萤火虫荧光素酶基因（LUC），绝缘子（INS）,hCMV 启动子，均送Invetrogen 公司完成测序，结果证实与GenBank报道完全符合.
　　2.3重组腺病毒载体PCR鉴定用萤火虫荧光素酶（LUC）基因引物扩增鉴定包装成功的重组腺病毒载体，扩增后可得416 bp的特异性条带，与阳性对照一致，阴性对照无特异性条带，正确的可调控重组腺病毒载体命名为Ad?RULUC(图2).
　　2.4Ad?RULUC重组腺病毒载体的滴度经鉴定的Ad?RULUC重组腺病毒载体在293细胞中扩增，用收集的病毒上清重复感染293细胞，可使病毒滴度升高，可调控腺病毒载体Ad?RULUC，病毒滴度达到5.2×1013pfu/L.
　　2.5Ad?RULUC重组腺病毒报告基因的表达可调控重组腺病毒载体Ad?RULUC经RU486诱导后的各组萤火虫荧光素酶的表达值的测定结果显示(图3), 没有加入诱导剂RU486时，重组腺病毒载体Ad?RULUC有少量的本底表达. 加入RU486时萤火虫荧光素酶的活性在一定范围内随诱导剂的浓度增加而升高，当RU486浓度达到1×10-6mol/L时，重组腺病毒载体的表达效能达到最大，萤火虫荧光素酶的活性是其基础表达的40余倍，此时继续增加RU486浓度而萤火虫荧光素酶的活性值不再升高. 经方差分析显示RU486诱导后荧光素酶基因的表达与阴性对照组的差异具有统计学意义(P<0.01). 复孔组实验细胞检测的结果显示，各组的相对荧光素活性与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)，表明去除诱导剂后，调控系统关闭，荧光素酶基因的表达终止.
　　1：阳性对照； 2：marker; 3：阴性对照； 4：PCR扩增鉴定marker.
　　图2重组腺病毒载体Ad?Ruluc PRC扩增鉴定（略）
　　图3RU486诱导重组腺病毒载体Ad?RULUC的表达（略）
　　3讨论
　　病毒载体介导的基因转移方法在目前的基因功能研究和基因中占有重要地位. 由于腺病毒载体具有感染效率高、安全性好、理化性质较稳定、外源基因的容纳量大等多种优点，因此，腺病毒载体系统是目前基因治疗中运用最广的病毒载体之一. 然而单纯利用腺病毒载体无法实现对目的基因的有效调控，基因的过度表达或不适当的表达不仅会影响基因表达的研究结果，而且对疾病治疗不利，甚至会对机体产生病理性损害，实现对基因表达的精确调控一直是载体系统的最大难题之一.
　　目前控制外源基因的表达有多种方式，而其中最有效的方式就是在转录水平的调控［3］. 早期可诱导基因表达系统有：重金属离子，金属硫蛋白，ITPG等，这些方案中存在基础表达差，背景表达很高，诱导剂毒性、具有多重效应、诱导的效能不足等诸多缺点［4］. 为了解决这些问题，生物学家们构建了多种新型的可诱导表达系统，提高了对目标基因调控的特异性和安全性，目前比较成熟的诱导表达系统主要有4种:四环素诱导调控系统、蜕皮激素诱导调控系统、纳巴霉素诱导调控系统和RU486诱导调控系统. 以上系统的原理都是利用反式激活因子与顺式调控元件作用的高度特异性，通过构建反式激活因子及顺式作用元件独立(或相对独立)的表达载体， 然后加入或除去诱导因子从而达到特异性激活靶基因表达的目的， 并可在一定程度上控制基因的表达量. 在已构建成的多种诱导调控系统中，由于RU486调控系统采用人孕酮受体的突变体为核心，以临床常用的小分子药物为诱导剂，在设计原理与结构上较其它调控系统更先进［5］，具有良好的应用前景. 本研究将RU486诱导调控系统引入到腺病毒载体中，构建成可调控的腺病毒载体，并在体外证实了其多种优点：本底表达低，诱导效率高，免疫原性小，诱导剂无毒性、靶向性好等优点［6］，使基因治疗更加安全可靠.
 
　　本研究中的可调控的腺病毒腺载体采用AdMaxTM腺病毒载体包装系统构建. 由腺病毒载体的鼻祖Dr. Frank L.Graham［7］创建的AdMaxTM腺病毒载体包装系统是通过Cre?loxP重组酶［8］介导下的位点特异性重组，使共转染到293细胞中的腺病毒载体穿梭质粒和辅助质粒（腺病毒基因组质粒）在重组酶的作用下产生重组腺病毒，得到的重组病毒是E1/E3缺失的复制缺陷型腺病毒. 与目前使用最普及的AdEasy系统相比［9］，有一定的优势：AdMax系统只需要2～4 wk就能完成从质粒构建到重组出毒，成功率大于98%（其中95%的克隆含有目的基因），因在真核细胞内重组出毒，保持了对腺病毒的生存压力，有助于重组腺病毒的基因组的完整性；而AdEasy系统的出毒成功率只有18%~34%，且在原核细胞（BJ5183）中完成病毒基因组重组［10］，理论上，失去了生存压力的腺病毒基因组更容易发生突变，病毒遗传背景及活性可能会受到影响. 在本次重组腺病毒载体构建中，本研究中，仅用10 d出病毒载体，且系统构建出的多株病毒克隆，经PCR证实均为正确，充分显示AdMaxTM腺病毒载体包装系统快速高效的优势.
　　综上所述，本研究成功构建了一种带有萤火虫荧光素酶基因并可经RU486诱导的可调控腺病毒载体，在体外证实了其良好的可调控性，为基因研究和治疗提供了新的工具.
 
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