高表达JNK3促进表阿霉素诱导的细胞凋亡

【摘要】  目的： 构建人c?Jun氨基末端激酶3（JNK3）真核表达载体，转染HEK293细胞，建立稳定表达细胞系；以表阿霉素作为凋亡诱导剂研究JNK3与细胞凋亡关系. 方法： 以pDBLeu?JNK3质粒为模板PCR扩增人JNK3基因全长，DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1/myc?His B，经PCR和酶切鉴定，DNA测序正确，脂质体转染法转染HEK293细胞，通过G418选择培养，建立稳定表达细胞系. RT?PCR，Western Blot检测携带Myc标签的JNK3融合蛋白的表达，流式检测表阿霉素对稳定表达JNK3基因的HEK293细胞的促凋亡作用. 结果： 成功构建了pcDNA3.1?JNK3真核表达载体并已稳定转入HEK293细胞，建立了稳定表达细胞系，成功地表达目的基因；与对照细胞相比表阿霉素能明显促进高表达JNK3基因的HEK293细胞发生细胞凋亡. 结论： JNK3稳定表达细胞系的建立和高表达JNK3促进表阿霉素诱导的细胞凋亡，为进一步研究JNK3的功能提供了良好的实验基础.

【关键词】  C?Jum氨基末端激酶 真核表达载体 转染 因表 细胞凋亡

　　0引言

　　c?Jun氨基末端激酶(c?Jun N?terminal kinases，JNKs)为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)超家族之一. 在脊椎动物，JNK由jnk1，jnk2，jnk3三种基因编码，表达的JNK1，JNK2，JNK3蛋白主要位于细胞质，为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶. JNK3与JNK1，JNK2的不同在于：JNK3有一个与位于JNK1，JNK2的N末端保守的甲硫氨酸残基融合在一起的延长的N末端区域［1］；JNK1，JNK2在组织内广泛表达，JNK3在脑、心脏、睾丸等组织特异表达. 近年来研究发现JNK3参与神经细胞凋亡的调控，可促进缺血、缺氧和有毒化学物质导致的神经细胞的凋亡. 目前对JNK3促细胞凋亡机制还不是很清楚. 我们通过构建稳定转染JNK3基因的细胞系，以表阿霉素作为凋亡诱导剂研究JNK3与细胞凋亡的关系，为研究JNK3促进细胞凋亡机制提供细胞模型.

　　1材料和方法

　　1.1材料菌株E.coli JM109，质粒pDBLeu?JNK3，pcDNA3.1/myc?His B和HEK293细胞由本实验室保存. DMEM，G418（Gibco公司）；胎牛血清（Life Technologies公司）；PCR及酶切产物纯化试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒、反转录试剂盒（Promega公司）；DNA Marker，DNA限制性内切酶(EcoRⅤ，XhoⅠ)、pyrobest DNA polymerase，rTaq酶（TaKaRa公司）；T4 DNA连接酶（New England Biolab公司）；Trizol、转染试剂脂质体lipofectamine 2000（Invitrogen公司）；AnnexinⅤ?FITC 试剂盒（晶美生物工程有限公司）；Myc抗体、actin抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG和ECL检测试剂（Santa Cruz公司）；其余试剂均为国产分析纯.

　　1.2方法

　　1.2.1引物设计与合成根据GenBank登录的人JNK3基因的序列(序列号为NM_002753)设计引物, 上游引物为：5′?ccggatatcATGAGCCTCCATTTCTTAT?3′，下游引物为：5′?ccgctcgagCGCTGCTGCACCTGTGCTG?3′，分别在上游引物和下游引物的5′端加入EcoRV，XhoI的酶切位点和3个保护碱基，引物由赛百盛公司合成.

　　1.2.2人JNK3基因全长的获取以pDBLeu?JNK3质粒为模板，采用PCR扩增人JNK3基因，全长1269 bp. PCR 50 μL反应体系中加pDBLeu?JNK3质粒模板1 μL，10×PCR Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 4 μL, 10 μmol/L JNK3上下游引物各2 μL，pyrobest DNA polymerase 0.25 μL，加无菌水至50 μL. 反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 80 s，35个循环；72℃ 10 min. PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离鉴定并胶回收纯化.

　　1.2.3人JNK3真核表达载体的构建将上述PCR产物和pcDNA3.1/myc?His B质粒分别用限制性内切酶EcoRⅤ和XhoⅠ酶切后，10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化，经T4 DNA连接酶连接后转化E.coli JM109感受态，铺在含氨苄青霉素的LB平板上筛选，选取阳性克隆进行菌落PCR和酶切鉴定，阳性克隆经测序分析后证实并命名为pcDNA3.1?JNK3.

　　1.2.4建立稳定表达人JNK3的HEK293细胞系HEK293细胞在含100 mL/L小牛血清的DMEM培养基中，于37℃，50 mL/L CO2 的饱和湿度下培养. 待细胞融合至70％～80％时按照Lipofectamine 2000操作说明书进行重组质粒pcDNA3.1?JNK3和空质粒pcDNA3.1/myc?His B的转染. 转染48 h后，用胰蛋白酶消化细胞，重新铺在直径为10 cm的细胞培养皿中，待细胞贴壁后，换含有G418(1400  mg/L)的选择性培养基加压培养2 wk，每3 d换液清除死亡细胞，待细胞培养皿中长出肉眼可见的单克隆时挑选单克隆并依次转移至96孔板、24孔板、6孔板、培养瓶内扩大培养. 筛选出的稳定表达人JNK3和Myc标签的HEK293细胞系，分别命名为HEK293?JNK3细胞和HEK293?mock细胞.

　　1.2.5RT?PCR检测JNK3的表达收集HEK293?JNK3细胞和HEK293?mock细胞，按Trizol试剂说明书抽提细胞总RNA，按反转录试剂盒说明书进行反转录. 取1 μg定量后的RNA，加水补至10 μL，70℃ 10 min，加10×反应缓冲液2 μL，MgCl2 4 μL，dNTP 2 μL，OligodT 1 μL，rRNasin 0.5 μL，AMV（15 U）0.75 μL. 反应体系共20 μL；42℃ 1 h；95℃ 5 min；4℃ 5 min. 以 GAPDH（900 bp）为内参进行PCR反应. 在25 μL PCR反应体系中加入cDNA模板1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L JNK3和GAPDH上下游引物各0.5 μL，rTaq酶0.15 μL，加水补足至25 μL，反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s, 72℃ 80 s，30个循环；72℃ 10 min. 取等体积RT?PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析.

　　1.2.6Western Blot 检测JNK3蛋白的表达收集筛选细胞，用含蛋白酶抑制剂的单去污细胞裂解液裂解细胞，4℃，12 000 g，离心10 min，收集上清. 对收集的蛋白样品进行定量，取20 μg处理后的蛋白样品进行SDS?PAGE电泳，电转移至PVDF膜上，50 g/L 脱脂奶粉室温振荡封闭2 h，与1∶2000稀释后的Myc一抗4℃ 孵育过夜，TBST洗膜3次. 然后与1∶5000稀释后的HRP标记的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL显色系统检测目的蛋白，显影.

　　1.2.7流式细胞术检测细胞凋亡对数生长期的HEK293?JNK3细胞和HEK293?mock细胞，调整细胞计数为2×108/L，接种于50 mL 细胞培养瓶中，常规培养24 h后，同时加入终浓度为0.2，0.5，1.0 mg/L的表阿霉素，空白对照组加入等量DMEM，继续培养48 h后收集细胞，进行Annexin V/PI标记：将细胞悬浮于250 μL 结合缓冲液中，调细胞数为1×109 /L, 加Annexin V/FITC 5 μL， 20 mg/L碘化丙锭溶液10 μL，混匀，室温避光孵育15 min，用适量稀释缓冲液稀释，流式细胞仪检测.

　　2结果

　　2.1人JNK3基因的扩增PCR扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，所得PCR片段约为1269 bp，与预期的人JNK3 cDNA全编码区的长度相符(图1).

　　2.2真核表达载体pcDNA3.1?JNK3的构建和鉴定筛选出的pcDNA3.1?JNK3阳性克隆质粒经EcoRⅤ和XhoⅠ酶切后得到2个条带(图2)，1条为约1300 bp大小的目的条带，1条为5500 bp大小的空载体条带；以pcDNA3.1/myc?His B载体上的通用引物进行测序，证实pcDNA3.1?JNK3重组质粒插人片段的序列与人JNK3的cDNA序列完全一致，表明人JNK3的真核表达载体构建成功.
 
　　1：DNA Marker(DL 2000)； 2：JNK3 PCR片段.

　　图1人JNK3基因的PCR扩增（略）

　　1：DNA marker(DL 15 000)； 2：pcDNA3.1/myc?His B； 3：pcDNA3.1?JNK3.

　　图2pcDNA3.1?JNK3重组质粒的双酶切鉴定（略）

　　2.3JNK3稳定细胞株的筛选和鉴定提取G418筛选出的稳定细胞株HEK293?JNK3和HEK293?mock细胞中的总RNA，RT?PCR检测JNK3的表达. HEK293?JNK3所提RNA能扩增出代表JNK3基因(1269 bp)及内参GAPDH基因(900 bp)的条带；而HEK293?mock细胞所提RNA仅能扩增代表内参GAPDH基因的900 bp的条带，说明JNK3基因在稳定细胞株中mRNA水平上得到了表达(图3). 提取HEK293?mock和HEK293?JNK3细胞中的总蛋白，Western Blot检测JNK3融合蛋白的表达，HEK293?JNK3用Myc抗体检测到约46 ku的JNK3融合蛋白条带，而HEK293?mock对照细胞则没有相应的条带,表明JNK3基因在稳定细胞株中蛋白水平上得到了表达(图4).

　　1：DNA marker(DL 2000)；2：HEK293?mock；3：HEK293?JNK3.

　　图3稳定细胞株中JNK3的RT?PCR分析结果（略）
 
　　1：HEK293?mock； 2:HEK293?JNK3.

　　图4稳定细胞株中JNK3融合蛋白的表达（略）

　　2.4流式细胞术检测表阿霉素诱导的细胞凋亡用0.2,0.5,1.0 mg/L 终浓度表阿霉素处理HEK293?mock细胞的凋亡率分别为25%，31%，78%；处理HEK293?JNK3细胞的凋亡率分别为38%，61%，93%. 与HEK293?mock细胞相比表阿霉素能明显促进高表达JNK3基因的HEK293细胞发生细胞凋亡（P＜0.05）.

　　图5高表达JNK3促进表阿霉素诱导的细胞凋亡（略）

　　3讨论

　　JNK信号通路是MAPK中重要的通路之一. 由JNK1，JNK2和JNK3成员组成，JNK1和JNK2在组织广泛表达，JNK3局限在大脑、心脏和睾丸表达. 近年来研究发现JNK3在帕金森综合征、阿尔茨海默、中风等神经退行性疾病中发挥重要作用［2］. JNK3与细胞凋亡密切相关. 稳定转染JNK3?p54的PC12细胞，能明显增强UV和紫杉醇诱导的细胞凋亡［3］. JNK3和p38促进亚砷酸钠诱导的皮质神经元凋亡［4］.  JNK3基因敲除小鼠可拮抗兴奋性毒性氨基酸诱导的海马区神经细胞凋亡［5］, 减少局部脑缺血缺氧导致的神经细胞凋亡 ［6-7］.

　　由于JNK3在组织表达非常局限，与细胞凋亡的关系又非常密切. 我们以pDBLeu?JNK3质粒为模板，通过PCR的方法获得人JNK3基因全长，并成功地将其插入pcDNA3.1/myc?His B载体的CMV启动子下面，构建了JNK3的真核表达载体. 经PCR和酶切鉴定后，用载体通用引物测序证明序列准确无误后，通过脂质体介导将pcDNA3.1?JNK3重组载体转染HEK293细胞，通过G418筛选建立了稳定表达细胞株，即HEK293?JNK3［8］. 以空质粒转染HEK293细胞为对照, 用RT?PCR和Western Blot方法分别从转录水平和蛋白水平检测了JNK3基因的表达，结果表明重组人JNK3基因在HEK293细胞中能被有效地转录和翻译，表明构建稳定表达JNK3细胞株成功. 以表阿霉素作为凋亡诱导剂，与空质粒转染HEK293细胞对照相比表阿霉素能明显促进高表达JNK3基因的HEK293细胞发生细胞凋亡，为进一步研究JNK3促进细胞凋亡机制提供了细胞模型.

【】
  　［1］ Gupta S, Barrett T, Whitmarsh AJ, et al. Selective interaction of JNK protein kinase isoforms with transcription factors［J］. EMBO J, 1996, 15(11):2760-2770.

　　［2］ Resnick L, Fennell M. Targeting JNK3 for the treatment of neurodegenerative disorders［J］. Drug Discov Today, 2004,9(21): 932-939.

　　［3］ Waetzig V, Herdegen T. A Single c?Jun N?terminal Kinase Isoform(JNK3?p54)Is an Effector in Both Neuronal Differentiation and Cell Death［J］. J Biol Chem, 2003, 278(1):567-572.

　　［4］ Namgung U, Xia Z. Arsenite?induced apoptosis in cortical neurons is mediated by c?Jun N?terminal protein kinase 3 and p38 mitogen?activated protein kinase［J］. J Neurosci, 2000, 20(17):6442-6451.

　　［5］ Yang DD, Kuan CY, Whitmarsh AJ, et al. Absence of excitotoxicity?induced apoptosis in the hippocampus of mice lacking the Jnk3 gene［J］. Nature, 1997, 389(6653):865-870.

　　［6］ Kuan CY, Whitmarsh AJ, Yang DD, et al. A critical role of neural?specific JNK3 for ischemic apoptosis［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100(25):15184-15189.

　　［7］ Pirianov G, Brywe KG, Mallard C, et al. Deletion of the c?Jun N?terminal kinase 3 gene protects neonatal mice against cerebral hypoxic?ischaemic injury［J］. J Cereb Blood Flow Metab, 2007, 27(5):1022-1032.

　　［8］ 杨俊霞，石华，魏丽丽，等，人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立［J］. 第四军医大学学报，2007，28（3）：210-213.