白细胞介素?12通过调整Th1/Th2细胞因子平衡抑制肺纤维化

【摘要】  目的： 研究白细胞介素?12(Interleukin?12，IL?12)对博莱霉素(Bleomycin，BLM)致大鼠肺纤维化的作用及机制. 方法: 采用完全随机设计将雌性Wistar大鼠60只随机分为4组, 即BLM模型组（1组）、IL?12干预组（2组）、BSA治疗对照组（3组）及生理盐水（NS）对照组（4组）. 第1,2,3组经气管注入BLM制备肺纤维化（PF）大鼠模型,第4组给予同等体积的NS. 制模后第1～12日腹腔注射干预药物,第2组为IL?12溶液，第3组为牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）溶液，制模后第7，14，28 日每组各处死5只大鼠，观察其病理改变、肺脏重量、肺组织匀浆中羟脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)水平及肺系数的变化，对病理切片进行肺泡炎和纤维化评分和灰度百分比分析. 测定支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中白细胞介素?4(Interleukin?4，lL?4)、γ?干扰素(Interferon?gamma，INF?γ)水平， IL?4/INF?γ比值. 结果: （1)与第4组比较,第1组出现明显肺泡炎及纤维化, 肺脏重量、肺系数、肺组织匀浆中Hyp含量增加，肺泡炎及纤维化评分增高，BALF中IL?4增加、IL?4/INF?γ比值增高，差异有统计学意义(均P<0.05)；灰度分析示7,14 d深染区百分比增加（P<0.01），7 d时浅染区百分比增加（P<0.05），但是BALF中INF?γ减少(P<0.05)；（2) 第3组各个指标同第1组比较差异无统计学意义；（3) 第2组与第1，3组比较肺泡炎及纤维化程度均减轻,7，14 d时的肺泡炎评分、深染区百分比以及28 d时肺纤维化评分、浅染区百分比减少，肺脏重量（7 d时）、肺系数、Hyp含量，BALF中IL?4含量减少， IL?4/INF?γ比值减低，差异有统计学意义(均P<0.05)，但是INF?γ含量增加（P<0.01）. 结论： IL?12 能通过调整Th1/Th2型细胞因子的平衡而对BLM所致大鼠肺纤维化发挥抗肺纤维化作用.

【关键词】  白细胞介素?12 肺纤维化 白细胞介素?4 干扰素Ⅱ型 羟脯氨酸 Th1细胞 Th2细胞

　　0引言
 
　　肺纤维化（Pulmonary fibrosis，PF）过程中存在着1型辅助性T细胞(Th1)和2型辅助性T细胞(Th2)细胞因子间的失衡,这种失衡与肺纤维化的形成有一定关系. IL?12可以促使Th1细胞的增殖分化产生Th1型细胞因子，抑制Th2细胞的增殖分化. 一般认为IL?4（代表Th2型细胞因子）、INF?γ（代表Th1型细胞因子）及IL?12的相互作用是维持Th1与Th2细胞平衡的关键，形成了Th1细胞与Th2细胞之间的相互抑制［1］. 本文观察了Thl/Th2细胞因子在肺纤维化形成过程中的变化，探讨IL?12是否具有调节Thl/Th2细胞因子失衡从而达到抗纤维化的作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　健康清洁级雌性Wistar大鼠60只，购自重庆医科大学动物实验中心，体质量（155±10）g. 博莱霉素(Bleomycin，BLM)，日本化药株式会社生产；IL?12购自美国Biosource国际公司；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）全组分，购自上海百萃生物有限公司；羟脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；IL?4和INF?γ ELISA试剂盒购自北京晶美生物制品有限公司.

　　1.2方法

　　1.2.1动物的分组及制模将大鼠60只随机分为4组：BLM模型组（1组）、IL?12干预组（2组）、BSA治疗对照组（3组）及NS对照组（4组）. 第1，2，3组经一次性气管内灌注4 g/L的 BLM(5 mg/kg)制备肺纤维化模型，第4组灌注相同体积的生理盐水. 模型建立后第1～12日腹腔内注射干预药物，第2组为1  μg重组大鼠IL?12（溶于100 μL的2 g/L BSA溶液），第3组为100 μＬ的2 g/L BSA溶液. 制模后第7，14，28 日每组各处死5只大鼠留取标本.

　　1.2.2标本的收集及处理将大鼠麻醉后心脏穿刺放血处死，称取体质量，左肺用手术线结扎，右肺反复行支气管肺泡灌洗并回收灌洗液，灌洗液混匀后-70℃分装冻存. 灌洗结束后取双肺，冲洗，滤纸吸干水分后称取肺脏质量. 右肺-70℃冻存，左肺待作病理切片，行HE和Masson三色染色. 检测时取少量右肺组织用碾磨的方法制作肺组织匀浆，按照试剂盒说明采用碱水解法测定Hyp含量. 取BALF按照ELISA试剂盒说明测定IL?4，INF?r水平，并计算IL?4/INF?γ比值. 按照肺系数=肺湿重（mg）/体质量（g）计算肺系数. 通过显微镜观察各组病理变化；对肺泡炎、肺纤维化进行评分. 通过计算机图象分析系统进行灰度分析，分别计算深染区、浅染区、无染区百分比. 其中深染区代表细胞核，反映炎症细胞浸润程度；无染区代表肺泡腔；浅染区在炎症高峰时反映间质水肿渗出的程度，在纤维化阶段反映细胞外基质的沉积多少.

　　统计学处理：实验数据采用SPSS13.0统计软件包进行处理，各组数据均采用 x±s表示，各组间采用成组设计的方差分析方法,组间多重比较采用LSD?t检验，检验水准α=0.05；肺泡炎及肺纤维化评分运用非参数检验，组间比较用Kruskal?Willis检验，多重比较用Nemenyi比较，检验水准α=0.05.

　　2结果
　
　　2.1肺脏质量、肺系数、Hyp含量的变化第1，2，3组7 d时肺脏重量，肺系数迅速增加，此后逐渐下降，28 d时肺脏质量较早期明显减轻，肺系数下降. 但第2组与1，3组比较，肺脏质量轻，差异有统计学意义（P<0.05），肺系数低，差异有统计学意义（P<0.05）. 第1，2，3组肺组织Hyp含量均呈时间依赖性增加，但第2组与第1，3组比较，Hyp含量低，差异有统计学意义（P<0.05）. 表1各组大鼠肺重、肺系数、Hyp的变化（略)

　　2.2肺组织病理变化BLM模型组大鼠第7日时表现为弥漫性肺泡炎，第14日时肺泡炎有所减轻，可见成纤维细胞增生及胶原沉积，偶有纤维母细胞灶形成，第28日时见肺泡结构萎陷、破坏，大量胶原沉积，肺泡间隔以及部分肺泡腔被胶原和纤维蛋白占据. BSA组改变同BLM组. 而IL?12干预组第7 日时肺泡炎程度明显减轻；第14日时仅见少量炎症细胞浸润，少量成纤维细胞增生；第28日时肺泡炎基本消退，仅见少量肺泡结构萎陷，少量胶原沉积在肺泡间隔. NS对照组未见明显的肺泡炎及纤维化表现(图1). 

　　2.3肺泡炎及纤维化评分IL?12干预组与BLM，BSA组比较，7,14 d时肺泡炎评分低，在28 d时肺纤维化评分低，差异有统计学意义（P<0.05，表2）.表2肺泡炎及纤维化评分情况（）

　　2.4灰度百分比分析而IL?12干预组与BLM，BSA组比较，7 d时深染区、浅染区百分比明显要低（P<0.01），28 d时，浅染区百分比明显减低（P<0.01），差别有统计学意义（表3）.表3灰度百分比统计结果（略)

　　2.5IL?4，INF?γ，IL?4/INF?γ比值的变化第1,2,3组IL?4水平均较NS对照组明显增高，而第2组IL?4增高幅度不及第1,3组大，差异有统计学意义（P<0.05). 第1,2,3组INF?γ水平均较NS组减低，但第2组和第1,3组比较, INF?γ水平明显增高,差别有统计学意义(P<0.01). 第1,2,3组IL?4/INF?γ比值较第4组明显增高，而第2组IL?4/INF?γ比值增高幅度不及第1,3组大，差异有统计学意义（P<0.05，表4）. 表4各组大鼠IL?4,INF?γ,IL?4/INF?γ的变化（略)

　　3讨论

　　目前许多学者认为肺纤维化与Th1/Th2型细胞因子失衡（Th2优势）有关. Th1型细胞因子以INF?γ为代表, 可能促进正常组织结构的修复，Th2型细胞因子以IL?4为代表，可能引起过度的损伤修复，细胞外基质蛋白沉积和纤维化. 当Th1/Th2型细胞因子平衡向Th2型细胞因子偏移时，可导致纤维化发生. Huaux等比较了IL?4(+/+)和IL?4(-/-)小鼠的博莱霉素所致肺部炎症和纤维化，发现IL?4(-/-)小鼠的肺纤维化程度较Il?4(+/+)小鼠轻［2］. Chen等在对INF?γ基因敲除(INF?γ［-/-］)小鼠和野生型正常小鼠气管内注射博莱霉素后研究发现，INF?γ(-/-)小鼠肺实质炎症、肺组织Hyp含量均较对照组明显减轻，提示INF?γ对减轻纤维化有重要作用［3］. 钱皓瑜等［4］对IPF患者和健康人血清和BLAF中IL?4, INF?γ的对照研究中发现IPF患者血清IL?4显著升高，而INF?γ降低，表明特发性肺纤维化患者存在Th2优势表达. 该研究还发现疗效差的特发性肺纤维化患者Th1/Th2失衡程度更高. 目前肺纤维化动物模型的制备已经比较成熟，本实验给予BLM制模的第1，2，3组大鼠，病理改变上均出现肺泡炎，并逐渐向肺纤维化进展的过程，提示制模成功. 而IL?12干预组与BLM，BSA组比较，肺脏质量轻，肺系数低，Hyp含量低，7，14 d时肺泡炎评分低，在28 d肺纤维化评分低，7 d时深染区、浅染区百分比明显减低，28 d时，浅染区百分比明显减低，提示IL?12可以减轻博来霉素诱导的肺纤维化.

　　IL?12在Th细胞亚群的分化中发挥重要作用，可促使Th1细胞的增殖分化产生INF?γ，抑制Th2细胞的增殖分化. 而INF?γ又能诱导吞噬细胞产生IL?12，而IL?4则抑制其产生. 此外INF?γ可以通过放大IL?12依赖的Th1分化，抑制Th2增生，而IL?4通过下调IL?12来抑制Thl细胞的增生. 总之， IL?4，IFN?γ及IL?12的相互作用是维持Th1与Th2型细胞因子平衡的关键. 在博莱霉素所诱导的肺纤维化模型中，IL?12基因敲除的小鼠与对照组相比肺纤维化程度加重，提示IL?12能抑制肺纤维化的晚期［5］. IL?12在减轻博莱霉素所致小鼠肺纤维化的同时，能引起时间依赖性的IFN?γ增多，而且这种抗纤维化作用能被同时给予的抗IFN?γ抗体削弱,提示IL?12通过调节IFN?γ的产生来削弱博莱霉素所致肺纤维化［6］. 本实验发现，第1，2，3组BALF中IL?4增加，INF?γ降低，IL?4/INF?γ比值增高，提示在肺纤维化大鼠存在Th2型细胞因子优势. 而Il?12干预组大鼠与BLM，BSA组比较，IL?4减少，INF?γ增加，IL?4/INF?γ比值减低，失衡得到一定程度纠正，提示IL?12可能通过调整Th1／Th2型细胞因子而发挥抑制肺纤维化作用，这为肺纤维化的治疗提供了新的途径和方向. 

【】
  　　［1］皱雄，张利宁. 《分子免疫学与临床》［M］. 济南：山东技术出版社,2003：207-208.

　　［2］Huaux F，Liu T．Role of IL?4 in lung injury and firosis［J］．J Immunol，2003，170(4)：2083-2092．

　　［3］Chen ES，Greenlee BM, Wills?Karp M．et a1．Attenuation of lung inflammation and fibrosis in interferon?gamma?deficient mice after intratracheal bleomycin［J］．Am J Respir Cell Mol Biol，2001，24(5)：545-555.

　　［4］钱皓瑜,马希涛. 特发性肺纤维化患者的Th1/Th2细胞因子失衡［J］. 误诊医学杂志,2004,4(7):1068-1069.

　　［5］Sakamoto H, Zhao LH, Jain F, et al. IL?12p40(-/-) mice treated with intratracheal bleomycin exhibit decreased pulmonary inflammation and increased fibrosis［J］. Exp Mol Pathol,2002,72(1):1-9.